乙肝疫苗联合CpG_ODN或单独应用对孕鼠及新生鼠的影响

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乙肝疫苗联合CpG_ODN或单独应用对孕鼠及新生鼠的影响

复旦大学儿科医院新生儿科复旦大学上海医学院儿科学系(上海300032)

张金萍肖昕*蒋建伟**刘秀香*


[摘要]目的探讨CpG_ODN作为免疫佐剂对乙肝疫苗诱导孕鼠及其新生鼠体液免疫功能影响,并观察注射CpG_ODN是否导致妊娠并发症发生。方法用CpG1826联合乙型肝炎病毒疫苗免疫孕期BALB/c小鼠,ELISA法检测孕鼠及其新生鼠血清IgG抗体。结果CpG_ODN可明显提高正常成年鼠IgG抗体水平(P<0.05),对孕鼠及其子鼠血清IgG水平无影响(P>0.05);20Lg/只的CpG1826剂量未影响新生鼠体重以及胎脑重量。结论以20Lg/只的CpG1826剂量免疫孕鼠,孕鼠及其新生鼠没有出现免疫增强作用,也未导致胎儿宫内发育迟缓(1UGR)等妊娠并发症。CpG_ODN是一种新型免疫佐剂,有较大的开发价值及广泛的临床应用前景,但在妊娠群体应用尚待进一步研究。

[关键词]CpG_ODN免疫孕鼠新生鼠
[中图分类号]Q95-3  [文献标识码]A [文章编号]1000-3606(2005)11-807-04

   1995年,Krieg等发现人工合成或细菌来源的非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸(GpG)DNA片段与纯化的B细胞体外共同培养,可使95%以上B细胞激活。众多研究表明含有CpG的寡聚脱氧核糖核苷酸(CpG_ODN)可增强体液免疫功能,使IgM、IgG和IgA抗体分泌增加。CpG_ODN作为免疫佐剂联合乙肝疫苗可以增强其免疫应答能力。本研究探讨CpG_ODN对孕鼠以及新生鼠抗体影响,为今后CpG_ODN应用于临床打下理论基础。
材料和方法
一、材料
1.寡核苷酸CpG1826:序列为:TCCAT-CACGTTCCTGACGTT全链硫代修饰,上海生物工程公司合成并PACE纯化合成。
2.疫苗悬液的制备:将40D的CpG1826与1支乙型肝炎疫苗混匀制成CpG_ODN疫苗悬液。
3.重组(酵母)乙型肝炎疫苗(5Lg/0.5ml),北京天坛生物制品股份有限公司生产;IgG干粉(10mg/支),购于北京鼎国公司。
4.BALB/c小鼠:6~8周龄,健康,20~25g/只,均为雌性,购于广州第一军医大学动物所。
二、方法
1.分组及处理:随机分为孕鼠组和非孕鼠组,每组又细分为3小组,即乙肝疫苗1Lg(0.1ml)组,乙肝疫苗1Lg+CpG20ug(0.1ml)组和生理盐水(0.1ml)对照组。在孕鼠组,BALB/c雌、雄小鼠同笼后第2天看孕栓。出现孕栓的时间作为孕期的开始(第1天)。于小鼠孕期的第1天和第14天,在各组小鼠左下肢胫前肌分别注射乙肝疫苗、乙肝疫苗+CpG或生理盐水;至孕期第21天,孕鼠分娩产出新生小鼠后,立即从孕鼠眼球取血,分离血清,-20℃保存,直至同批测定抗体IgG(ELISA法)。非孕鼠的给药时间、给药方式、给药种类及处死时间与其配对的孕鼠相同。小鼠(孕鼠和非孕鼠)处死后取出脾脏和胎鼠,立即称胎鼠体重和胎脑重量。新生鼠断头取血,分离血清,-20℃保存,直至同批测定抗体IgG(ELISA法)。
2.ELISA法:用包被稀释液将乙肝疫苗(HBsAg)稀释至1g/ml,每孔100ul包被96孔酶标板,4℃过夜,用PBS洗涤3次,每次5min,用5%小牛血清加满每孔,37℃封闭1h,用PBS洗涤3次,每次5min,加待检血清,每孔100ul设3复孔,设阳性和阴性对照,37℃温育2h,用PBS洗涤3次,每次5min,每孔加入1：1500稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG100ul,37℃温育2h,用PBS洗涤3次,每次5min,每孔加入OPD_H2O-底物反应液100ul,37℃避光显色,50ul(2mol/L)H2SO4溶液终止反应,在酶标仪上读取每孔的OD490值。
三、统计学处理所有数据采用SPSS10.0软件进行处理。检验前各组数据进行正态性检验和方差齐性检验,非正态分布数据经数据转换成为正态分布数据后再进行统计处理,P<0.05差异有显著意义。
结果
一、孕鼠组抗体IgG水平
1.标准曲线制作:通过ELISA法测定不同标准IgG浓度下的OD值,得出标准曲线方程为Y=
0.218X+0.016。
2.正常非孕鼠、孕鼠抗体水平:孕鼠组,无论是单独应用乙肝疫苗还是联合应用乙肝疫苗和CpG1826,不能使抗体IgG产生增加(P>0.05),均低于非孕鼠组的相应各小组(P<0.01);非孕鼠组,即正常成年鼠,联合应用乙肝疫苗和CpG1826者的血清IgG水平升高最明显(P<0.01),单独使用乙肝疫苗者的IgG水平也明显升高(P<0.05)。
见表1。



3.胎鼠IgG水平:无论是单独应用乙肝疫苗还是联合乙肝疫苗和CpG1826免疫孕鼠,对其新生鼠IgG水平无明显影响,差异无显著性(P>0.05)。见表2。



二、乙肝疫苗单独或联合CpG免疫孕鼠后对新生鼠体重与大脑重量影响无论是单独应用乙肝疫苗还是联合应用乙肝疫苗和CpG免疫孕鼠,其分娩的新生鼠的体重及大脑重量与未接种疫苗和/或CpG孕鼠所分娩的新生鼠差异无显著性(P>0.05)。见表3。



讨论
   从现代生殖免疫的观点来看,胎儿对于母体而言类似移植物,胎儿在母体中发育长达40周,其妊娠成功与否取决于胎母间免疫关系是否平衡。妊娠时人类胎盘蜕膜中免疫细胞产生Th1、Th2型细胞因子,母胎界面免疫反应以Th2细胞为主;Th2型细胞因子保护胎儿免受排斥,例如IL_10可以抑制淋巴细胞的增殖和IFN_C的分泌,避免淋巴细胞对滋养层细胞的杀伤,有利妊娠进行。Th1型细胞因子过度分泌与病理性妊娠有关,母体内IFN_C和TNF_A水平过高,可能会导致胎死宫内、流产、早产和宫内生长迟缓(IUGR)等并发症。Th1型细胞因子释放,使凝血酶表达增高,促进入滋养层细胞凋亡,导致流产率增加。但Th1型细胞因子在抵抗宫内感染方面起重要作用。在高度增殖和侵袭性细胞滋养层细胞分布着IFN_C受体,与IFN_C结合可以防止胎盘过度生长。妊娠早期TNF诱导蜕膜细胞的凋亡,保证滋养层细胞迅速侵入母体子宫壁,破坏子宫螺旋动脉,转化成血窦利于血供,过量TNF_A能促进分解代谢,以满足胎儿的需要。妊娠后Th1/Th2必须在一定范围内保持一定平衡,以增强Th2介导的体液免疫,偏离Th1介导的细胞免疫为主,才能维持妊娠的正常进行。
   在我国,约10%孕妇处于乙肝病毒携带状态或为乙型肝炎患者。一般认为妊娠早期患肝炎易引起自然流产,而后期可导致早产或胎儿先天性感染。尽管目前对这一类高危儿在围产期采取了乙肝疫苗加特异性免疫球蛋白的防治措施,但仍有部分新生儿(尤其早产儿)没有达到预期的免疫效果,其中原因可能是疫苗中免疫佐剂为Al(OH)3,仅能增强Th2类免疫反应,对Th1反应和细胞免疫反应有抑制作用。目前众多的研究表明CpG_ODN可特异性增加抗原免疫原性,激活多种效应细胞,产生某些细胞因子,诱导IL_12的产生,刺激辅助性Th1细胞产生TNF_A,并可辅助Th2细胞反应转化为Th1细胞反应。有鉴于此,将CpG_ODN作为乙肝疫苗的佐剂与疫苗一起同时免疫孕鼠后,观察乙肝疫苗免疫原性的改变,对孕鼠及其新生鼠的特异性抗体IgG水平的影响,以及出现的不良反应,为乙肝疫苗佐剂的改进、临床应用乙肝疫苗的最佳时机提供实验依据。
   研究结果提示,妊娠期间母鼠的免疫力普遍降低或处于抑制状态,使用CpG_ODN刺激后没有明显的改善(仅有增高的趋势),更不能达到非孕期状态。这可能是孕鼠体液免疫功能的真实反映(妊娠本身对于母体就是一个免疫抑制过程,即使用抗原和/或免疫佐剂刺激,所产生反应也较弱),也可能是由于我们观察的例数较少或CpG_ODN剂量较低有关。若是后一种原因,那么可能通过增加CpG_ODN的使用量和观察样本例数得到预期的结果。孕鼠应用乙肝疫苗联合CpG_ODN免疫后,一方面对其所分娩的新生鼠的体重和大脑重量无影响,提示在本实验剂量范围下,CpG_ODN作为免疫佐剂用于孕鼠未导致IUGR,有一定的安全性;另一方面也未使新生鼠的IgG抗体增高。其原因可能是给予孕鼠的CpG_ODN剂量过小,但也不排除CpG_ODN的确与其他免疫增强剂不同的可能性,虽然对母鼠及子鼠抗体有增高的趋势,但会在一定水平上自然平衡母体的免疫状态,从而不会导致以上妊娠并发症的出现。因此,我们下一步将增加孕鼠的CpG_ODN注射量,观察孕鼠CpG_ODN给予剂量与新生鼠抗体的产生和不良反应之间的相关性。如果通过实验可以验证CpG_ODN在孕鼠中的有效性和安全性,那么可为今后CpG_ODN真正应用于临床打下重要的理论基础。深入了解是否外源性改变Th1/Th2细胞因子平衡会对母胎产生影响,为今后如何增加孕母免疫力,减少早产、流产和IUGR提供理论基础。众多研究表明CpG可增加抗体生成,增强Th1反应。孕妇妊娠期间,原有的与细胞免疫有关的疾病如风湿性关节炎得以缓解,而与体液免疫有关的疾病SLE和哮喘在孕期加重。我们大胆提出这一假设:由于妊娠可加重与体液免疫有关的疾病病情,因此对原患有这类疾病的孕妇是否应用CpG_ODN来抑制Th2型细胞反应,协调Th1/Th2型细胞反应的平衡,从而达到控制此类疾病病情的目的。验证这一假设将是我们下一步研究工作的重点。