Nature子刊:开发循环microRNA检测新方法

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最近，来自深圳大学生命与海洋科学学院苟德明教授领导的研究团队在Nature杂志子刊ScientificReports上发表了一篇最新研究进展，他们利用S-Poly(T)Plus实时荧光定量PCR对microRNA的检测方法进行了改进。

MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于真核生物。miRNA的主要功能是通过与mRNA的3’端非翻译区结合，降解靶mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上抑制基因的表达，广泛参与细胞的分化，增殖，凋亡，个体生长发育以及器官形成等生物学过程。生物体内miRNA被精密调控，其表达具有严格的时空特异性。研究表明miRNA的表达异常与许多癌症或者其他疾病的发生密切相关，而且miRNA可以在血液中以非常稳定的形式存在。所以循环miRNA作为新型生物标记物有着巨大的潜力，可用于癌症等重大疾病的早期诊断和预后评估等。然而，由于血液中的miRNA含量甚微，对检测的灵敏度和特异性要求很高。

基于实时定量PCR(qRT-PCR)的检测技术一直被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一。目前，用qRT-PCR技术检测miRNA包括比较常用的poly(A)加尾法和茎环引物(Stemloop)法。由苟德明教授研究团队早期发明的S-Poly(T)?法融合了传统的Stem-loop法和Poly(A)加尾法的优点，使用了与miRNA3`端特异互补的~6个碱基和11个Oligod(T)组成的S-Poly(T)?特异性逆转录引物，在较高温度下(≥42°C)对加尾后的miRNA进行第一链cDNA的合成，不仅显著提高S-Poly(T)逆转录引物与目的miRNA互补结合的特异性和热稳定性，而且逆转录效率更高，从而大幅提高目的miRNA第一链cDNA的合成及后续qPCR效率。但是在S-Poly(T)方法中，miRNA的Poly(A)加尾和反转录是两步独立的反应，因此在操作简便性和逆转录效率方面有待改进和提高。

最新发表在ScientificReports的S-Poly(T)Plus技术是对S-Poly(T)的进一步升级，将原本分开的加尾和逆转录两步反应同时进行，不仅操作简便，降低RNA降解的风险，缩短检测时间，而且提高了检测的灵敏度（约4倍）。研究人员又通过一种改进的总RNA分离方法进一步提高了循环miRNA检测的灵敏度。通过对各项指标的优化，提出了循环microRNA检测的整体解决方案，从100μl血清或血浆中可以实现200~300个miRNA的检测，是目前国际上最灵敏的microRNA检测方法，特别适合于寻找与人类重大疾病相关的循环microRNA生物标志物。

为对这一改良方法进行验证，研究人员利用该方法对患有先天性心脏病合并肺动脉高压患者的血清进行了miRNA表达谱定量分析，结果在该病人群体中发现了2个显著上调的miRNA和5个显著下调的miRNA，证明了该方法具有很好的应用价值。

综上所述，深圳大学苟德明教授研究团队开发的这种简单，灵敏同时具有良好特异性的循环系统miRNA检测方法为miRNA基础研究和基于miRNA生物标记物的人类疾病诊断提供了新的工具，对于进一步探索miRNA的奥秘具有重要推动意义。

An improved method for detecting circulating microRNAs with S-Poly(T) Plus real-time PCR

Yanqin Niu, Limin Zhang, Huiling Qiu, Yike Wu, Zhiwei Wang, Yujia Zai, Lin Liu, Junle Qu, Kang Kang & Deming Gou

We herein describe a simple, sensitive and specific method for analysis of circulating microRNAs (miRNA), termed S-Poly(T) Plus real-time PCR assay. This new method is based on our previously developed S-Poly(T) method, in which a unique S-Poly(T) primer is used during reverse-transcription to increase sensitivity and specificity. Further increased sensitivity and simplicity of S-Poly(T) Plus, in comparison with the S-Poly(T) method, were achieved by a single-step, multiple-stage reaction, where RNAs were polyadenylated and reverse-transcribed at the same time. The sensitivity of circulating miRNA detection was further improved by a modified method of total RNA isolation from serum/plasma, S/P miRsol, in which glycogen was used to increase the RNA yield. We validated our methods by quantifying miRNA expression profiles in the sera of the patients with pulmonary arterial hypertension associated with congenital heart disease. In conclusion, we developed a simple, sensitive, and specific method for detecting circulating miRNAs that allows the measurement of 266 miRNAs from 100 μl of serum or plasma. This method presents a promising tool for basic miRNA research and clinical diagnosis of human diseases based on miRNA biomarkers.