高分辨熔解曲线分析在临床细菌鉴定和药敏检测中的应用

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黄磊：各位观众朋友，大家好！欢迎收看《中华检验医学杂志》“专家论坛”导读。我是主持人黄磊，我来自北京大学第一医院。

即将在《中华检验医学杂志》发表的《高分辨熔解曲线分析在临床细菌鉴定和药敏检测中的应用》一文中，作者精炼地介绍了高分辨熔解曲线分析的特点，并且第一次在国内系统地介绍了其应用于临床细菌鉴定和药敏检测的优势和广阔前景。

为了更好地了解高分辨熔解曲线分析在临床细菌鉴定和药敏检测中的应用，今天我们有幸邀请到该文的通信作者——同济大学附属东方医院南院医学检验科主任，主任技师，博士研究生导师吴文娟主任来到现场。请吴主任与我们谈谈高分辨熔解曲线分析在病原学分子检测中有哪些优势和应用前景。

吴主任您好！非常欢迎您的到来!

首先请您简单介绍一下高分辨熔解曲线分析用于细菌鉴定和分型的基本原理和优势。

吴文娟：目前感染性疾病病原学诊断的金标准仍然为培养的方法。然而传统的培养技术耗时较长，往往不能满足临床诊治的需求。核糖体DNA及其他具有高度保守性的基因具有良好的进化保守性，成为病原体分子鉴定和分型的标准标识序列。HRM的基本原理是双链DNA随着温度升高变性形成单链DNA，其中50% DNA 分子发生变性的温度称为熔解温度。荧光染料与双链DNA结合时才能够发出荧光，当DNA变性形成单链时，荧光染料自DNA链上脱落下来，荧光信号便急剧减弱。以温度为横坐标对荧光信号作图，即可得到熔解曲线。DNA链中的任何突变及GC含量的改变都会影响熔解曲线的Tm值及峰形，根据熔解曲线的峰形及特定的Tm值即可对某种细菌进行鉴定或分型。HRM可检测特定的单核苷酸多态性，发现新的SNP。

黄磊：我们知道，可以通过16S rDNA保守区测序来进行细菌鉴定，目前已应用较为成熟，HRM与测序相比，有什么优势吗？

吴文娟：使用16S rDNA保守区测序来进行细菌鉴定时，PCR扩增产物需要进行测序，经过比对后，根据可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行鉴定。以16S rRNA基因作为靶基因进行的HMR分析技术，在PCR后可直接进行熔解曲线分析，真正实现了实时的闭管检测，具有操作便捷、灵敏度高、结果准确、成本低廉等优势，是分子生物学技术应用于临床菌株诊断的重要进展。近两年来有多项研究利用PCR-HRM技术对细菌感染性疾病的病原菌进行了快速鉴定。比如，16S rDNA测序在非结核分枝杆菌菌种鉴定时不能鉴别鸟-胞内分枝杆菌复合群，而PCR-HRM以16S-23S rRNA 内部间隔序列为靶标的HRM分析能够一次反应鉴别12种非结核分枝杆菌。PCR-HRM分析对临床病原菌快速、准确的鉴定，为感染性疾病的及时治疗提供了极大的帮助。

黄磊：我们知道HRM用于细菌鉴定和分型时，目的片段的选择和引物设计非常重要，在这两方面想请您谈谈基本的原则和注意事项。

吴文娟：根据分析的目的不同，HRM引物可以是通用引物，也可以是特异性引物，但所扩增的片段必须具有较强的特异性。根据PCR扩增片段的特点、长度，HRM分析方法主要分为包括小片段扩增法和非探针标记法。小片段扩增法方法检测SNP是基于Tm值发生变化，因此扩增片段越小（50-150bp），越有利于HRM分析。小片段扩增HRM法能够检测到单个碱基G/C→A/T突变的最长DNA片段为200bp。然而当扩增子序列中存在与疾病无关的多态性位点时，多态性位点会影响熔解曲线的解读，这时可以采用非探针标记法HRM进行解决。即在HRM的基础上加入一种不带荧光标记的探针，由原来的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与探针两部分组成的模式，根据非标记探针与模板结合后的探针熔解峰Tm值大小来分析不同的基因型。

黄磊：HRM进行细菌鉴定和分型目前是否可以在临床实验室常规开展？是否已有商品化的试剂盒？

吴文娟：由于其操作简单、结果准确、耗时短及成本低等优点，在国外已经广泛应用于许多实验室自建项目的临床检测中，如梅奥医学中心使用自建的HRM技术鉴定和分型疟原虫、微孢子虫和奴卡菌等。在国内由于尚未开放临床实验室自建分子检测项目，目前主要用于科研或流行病学调查，未应用于临床标本检测。随着交叉学科的发展，基于熔解曲线分析的微流控床旁一体化检测技术已逐步从研究走向临床。例如，可检测呼吸道感染、血流感染、中枢神经系统感染和胃肠道感染的多种病原体靶标以及抗生素耐药基因的FilmArray™ 系统。该技术利用巢式二步PCR结合熔解曲线分析 ，PCR 产物熔解曲线提供了产物特异的“指纹图谱”，实现多重、高灵敏度和高特异性检测。该方法检测一个样本时间仅为约 1 小时，并且在一个密闭系统中进行提取、扩增和检测，可最大限度减少污染。快速获得的检测结果所提供的必要信息有助于初级医护人员和急诊室医生更好地对患者进行分诊，为感染性疾病诊治带来创新性突破。

黄磊：我们知道质量控制在分子生物学检测中是非常重要的，HRM进行细菌鉴定和分型在质控方面有哪些注意事项？相比于其他分子检测方法，有什么特殊要求吗？

吴文娟：在质控方面有两种方案可以实现：第一种是使用标准菌株作为质控品；第二种则是以标准菌株基因片段为质控品，PCR扩增产物与标准菌株基因片段混合后通过HRM分析DNA杂化双链的存在。标准菌株或基因片段能够作为质控品的前提是要保证其序列的正确，因此需要定期进行测序确认。

黄磊：HRM可以检测细菌的耐药基因突变，它与目前已经商品化的检测系统（例如GeneXpert）相比一致性如何？是否有这方面的文献报道？

吴文娟：抗菌药物作用靶点基因突变是细菌产生耐药性的主要机制之一。因此，利用HRM方法检测与细菌耐药相关基因的位点突变，能够快速准确地判定病原体的耐药性。在2013年JCM中的一篇文献[1]中，作者比较了包括GeneXpert和HRM在内的14种分子生物学的方法对支气管灌洗液中结核分枝杆菌复合群的检测能力，发现GeneXpert的方法在敏感性比其他13种方法低10-100倍。文章中分析认为，可能不同的方法对DNA纯度的要求不同，GeneXpert要求DNA纯度高的检测，其检测的敏感性就会降低。

黄磊：最后再从技术层面提一个问题，使用HRM进行细菌鉴定和分型，对仪器、试剂和人员操作有什么特殊要求吗？有哪些原因会产生假阳性或假阴性结果吗？

吴文娟：HRM进行细菌鉴定和分型，人员要求具有基因扩增技术专业能力（持培训上岗证），当然从事微生物检测还需要生物安全培训和基本的临床微生物学检验能力。试剂方面，目前HRM分析所用的荧光染料主要是饱和荧光染料，如LC GreenPlus（idaho）等。饱和荧光染料不仅与DNA有更强的结合能力并且对PCR反应无抑制作用。饱和荧光染料在饱和浓度条件下对DNA双链进行标记，在升温解链的过程中不会发生染料分子之间的重排，细微的序列差异即可通过荧光信号的变化体现出来。HRM的目的是能够对单个碱基差异进行区分，因此除了对荧光染料有特殊要求外，其对real-time PCR仪要求也较高。需要PCR仪孔间温度差异小于0.2℃，每步升温0.02-0.1℃，而且每升高1℃荧光采集次数大于10次。此外，为了提高HRM检测的灵敏度和分辨率，相关仪器还需要高能量的激发光源以检测熔解曲线的微小变化。否则，可能导致灵敏度降低或假阴性。

黄磊：非常感谢今天吴主任为我们耐心解答了这么多有关HRM在病原学分子检测域应用的问题，让我们对HRM未来在临床微生物实验室进一步推广也充满了希望，谢谢吴主任！

如果大家想进一步了解更多关于HRM的详细内容，请大家参考吴主任在本刊的“专家论坛”撰写《高分辨熔解曲线分析在临床细菌鉴定和药敏检测中的应用》一文，谢谢！

专家简介

吴文娟，同济大学附属东方医院南院医学检验科主任，主任技师，博士研究生导师。上海交通大学医学院病原生物学博士、美国范德堡大学医学院、美国梅奥医学中心访问学者。

中国女医师协会检验医学分会副主任委员、中华医学会结核病学分会基础委员会委员、中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组委员、中国老年医学学会检验医学分会委员、中国中西医结合学会检验医学专业委员会感染性疾病检验诊断学术委员会副主任委员、上海市微生物学会理事兼临床微生物学专委会副主任委员、上海市医学会检验分会委员、中国合格评定国家认可委员会评审专家、上海市分子诊断技术评审专家等。

研究方向为感染性疾病实验诊断、病原微生物分子检测及耐药机制、医院感染控制等。主持国家科技重大专项课题1项、国家自然科学基金2项、省市级纵向课题6项、入选浦东新区学科带头人，副主编、参编专著9部，近年以第一作者或通讯作者发表SCI、核心期刊论文57篇，申请专利5项。

主持人简介

黄磊，博士，副研究员，北京大学第一医院检验科。

主要从事临床微生物检验及相关科研工作，以第一作者发表SCI论文4篇、核心期刊论文8篇，作为课题负责人承担国家自然基金青年基金、教育部博士点新教师基金等课题。

北京医学会检验医学分会微生物学组委员，中国微生物学会医学微生物与免疫学分会真菌学组委员。

|    本文编辑  ：  唐栋    |