与HIV感染相关的宿主细胞蛋白

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【关键词】  HIV感染; 宿主相关蛋白; 抗HIV药物

HIV是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体, 它主要有1型和2型。大多数AIDS是因为感染HIV1而引起的。HIV是有包膜的逆转录病毒, 以芽生方式从细胞获得病毒包膜［1］。由于HIV1自身仅编码15种蛋白质, 因此HIV的成功感染必须在很大程度上借助宿主细胞的功能。譬如, HIV进入宿主细胞, 必须依赖于宿主细胞膜上的CD4分子和辅助受体（CXCR4或CCR5）。鉴于这一点, 若能通过研究发掘出与HIV感染各阶段有关的宿主蛋白质, 将能大大增加抗HIV药物的药物靶点数目。实际上, 2008年新批准的抗艾滋病药物Maraviroc, 就是以辅助受体CCR5为靶点的小分子辅助受体拮抗剂。最近, Brass等［2］采用涵盖全基因组的大规模干扰RNA（siRNA）荧光筛选技术, 确定了273种HIV依赖因子（HIV dependent Factors,  HDFs）。其中的36种（13％）为人类所已知, 包括CD4、  CXCR4、  NMT1、  Rab9p40以及NFκB和CREB等反式激活元件等, 其余的237种则前所未知。在此次研究中, 他们还发现HDFs在人类免疫细胞中呈现高表达状态, 这也说明了HIV非常“聪明地”选择了能够为它们的生命活动提供最佳环境的宿主细胞。

根据Brass等的研究成果, 结合以往的研究, 我们把文献报道的这些与HIV感染有关的宿主蛋白, 按照病毒感染的阶段进行分类, 简述它们的功能, 从而为盘点抗HIV药物可能的潜在靶点奠定基础。

1  HIV基因及其编码蛋白

HIV是所有逆转录病毒中基因组较为复杂的一种病毒。其相对应的蛋白如表1所示。其中组特异性抗原基因 gag 编码聚合蛋白, 由蛋白酶切割后形成基质蛋白（MA/p17）、 核衣壳蛋白（NC、 p6）和衣壳蛋白（CA/p24）;  聚合酶基因pol编码逆转录酶（RT）、 整合酶（IN）和蛋白酶（PR）;  包膜糖蛋白基因env编码gp120和gp41两种糖蛋白。 此外, HIV还有2个必须调节基因（tat,  rev）和4个非必须调节基因（vif,  nef,  vpu,  vpr）分别编码2个调节蛋白（Tat,  Rev）和4个辅助蛋白（Vif,  Nef,  Vpu,  Vpr）。近年来发现那4个所谓的非必须调节基因其实对HIV的感染也非常重要［1, 3, 4］。

2  HIV感染相关的宿主蛋白

2.1  HIV进入相关的宿主蛋白  早前的研究已经证实了CD4分子与辅助受体是HIV进入的必要蛋白质。具体来说, HIV gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体（趋化因子受体CCR5或CXCR4等）结合, 导致 gp41的构型发生改变, 启动病毒胞膜与靶细胞膜的融合［5］。如果说CD4分子与辅助受体促进HIV直接感染宿主细胞, 那么DCSIGN则是HIV1通过另一种机制来提高病毒感染力的一种蛋白质。DCSIGN是一种表达在树突细胞上的C类型凝集素。多项研究表明, 虽然树突细胞本身并不感染HIV, 但是当由gp120介导的HIV1病毒颗粒结合到DCSIGN上时, 病毒感染那些与树突状细胞有联系且表达CD4及辅助受体分子的细胞的能力将会大大提高。因此, 负载病毒的树突状细胞与易感T细胞之间的联系, 可将CD4分子、 辅助受体及病毒颗粒之间的距离大大拉近, 从而增加了T细胞被感染的可能性［6］。除了DCSIGN之外, 其他的C类型凝集素受体, 如 DCSIGNrelated（DCSIGNR）、 甘露糖受体（MR）、 郎格汉斯细胞特异蛋白（Langerin, 又名CD207）, 也可与gp120结合, 可能发挥着HIVⅠ受体的作用［7］。在gp41亚基相关的宿主蛋白方面, 有研究表明窖蛋白1（caveolin1）能与gp41形成稳定的复合体, 我们的研究还进一步找出了其与gp41核心结构域结合的基序ΦXXXXΦXΦ。此外, 还发现蛋白Epsin1能通过一个NPF基序与gp41的核心结构域结合。窖蛋白1和Epsin1可能与HIV1通过内吞（endocytosis）方式进入靶细胞的过程有关。

由胞内体到高尔基体的退行性小泡运输是HIV感染所必需的, 尤其是在病毒的进入阶段。Brass AL等的研究表明, 调节高尔基体向内质网转运的Rab6A, 对高尔基体固有酶的循环利用起着非常重要的作用;  经过选择性剪切而与Rab6A相差三个氨基酸的Rab6A’, 调控着胞内体的转运。这两个亚型共同称为Rab6。Rab6的减少将直接导致HIV感染能力的降低。同样的结果在Vps53（一种高尔基相关蛋白的成份）上也得到了证实［2］。另一个与HIV感染早期病毒与宿主胞膜融合关系密切的非蛋白物质是脂筏。脂筏是细胞质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域。研究表明, gp120、 CD4分子和辅助受体所形成的三元络合物的构型以及后续的膜融合均发生在这些膜微区内［6］。

2.2  HIV逆转录相关的宿主蛋白  目前鉴别出的一种宿主蛋白, 名为APOBEC3G, 是胞苷脱氨酶家族中的一员。它与病毒颗粒结合, 可以在HIV逆转录过程中使胞嘧啶转换为尿嘧啶, 从而产生了两个结果: 通过宿主的尿嘧啶DNA糖苷酶和修复酶使新合成的病毒DNA降解, 或使逃脱降解并已整合的DNA发生G到A的超突变, 由此限制了感染后病毒DNA合成的数量和质量［6］。

Vif, 全称病毒感染性因子, 大大增加了病毒颗粒对抗这种细胞抗病毒因子所致失活效应的能力, 并且促进了病毒在人类CD4＋T细胞中的复制［8］。Vif发挥的关键作用就是与APOBEC3G结合并诱导其降解, 从而防止APOBEC3G与病毒颗粒结合, 抑制APOBEC3G的活性［6］。一些最新的研究还发现, Vif对HIV1感染细胞周期的G2期停滞起促进作用。Vif的单独表达将会诱导G2期的延长, 而剔除Vif或Vpr的病毒所产生的细胞周期停滞少于野生型病毒, Vif与Vpr皆剔除的病毒感染细胞则表现为无感染症状［8］。

除了APOBEC3G, 还有一些宿主因子也是在早期发挥限制病毒复制的作用的, 如Fv1、 Ref1和 Lv1, TRIM5α, APOBEC 等［6, 9］。

核转录因子NFκB, 对HIV的起始转录起着关键作用。它能结合到病毒的长末端重复（LTR）上, 从而使得病毒蛋白Tat产生, 而Tat蛋白可以大大增强病毒的转录过程［10］。

亲环素A作为一种宿主蛋白, 通常在蛋白质折叠期发挥作用。它结合在HIV1 Gag衣壳区内的富含脯氨酸的暴露环上, 并在病毒进入后的早期提高病毒的感染力［10］。此外, 核胞浆转运蛋白TNPO3是病毒mRNA剪切之前所需要的。缺乏TNPO3的细胞感染将会被阻断在病毒转录之后、 整合之前［2］。表1  HIV基因、 编码蛋白、 功能及与之相关的宿主细胞相关蛋白

感染发展为AIDS的重要因子PACS1、 ASKl、 PAK、 PI3K、 Lck、 VAN/NAFlvifVif病毒感染性因子, 促进病毒装配和成熟APOBEC3GvprVpr病毒蛋白r, 转运病毒DNA至细胞核, 抑制细胞生长Karyopherins、  UracilDNA glycosylase、 WeelvpuVpu病毒蛋白u, 促进病毒释放CD317 (Tetherin,  BST2)

2.3  HIV整合相关的宿主蛋白  许多逆转录病毒必须等到宿主细胞有丝分裂期间核膜破裂后, 才能够将自身的DNA整合到宿主DNA上。然而, 慢病毒属进化出一种机制, 即凭借整合前复合物（PIC）即可被运送到核膜内, 它使得慢病毒属能够感染不分裂的细胞, 如巨噬细胞。在PIC中, 现检测到几种宿主蛋白, 包括由89个氨基酸构成的多聚体蛋白BAF;  高迁移率组蛋白HMGa1;  INinteractor 1 (Ini1), 它是参与染色体重建的SNFSWI (sucrose nonfermentingswitch) 复合物的组成成份;  晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）, 有报道表明它可能与IN一起参与入核转运或自身参与整合过程。关于这些宿主蛋白在细胞核中如何提高整合效率的机制, 还有待进一步的研究［6］。

2.4  HIV cDNA转录相关的宿主蛋白  HIV1的反式激活蛋白Tat与拥有59个核苷酸茎环结构的反式激活应答（TAR）元件相互作用, 能够强有力地激发由HIV1长末端重复序列（LTR）开始的转录。TAR位于转录起始位点的下游区［6］。Tat为转录延长所必需的蛋白质, 但它不能单独作用, 而必须与人类12号染色体编码的细胞周期蛋白T（cyclin T）共同作用: Tat先直接与cyclin T相作用, cyclin T再依次募集细胞周期蛋白依赖激酶CDK9到TAR元件上。Cyclin T与CDK9所形成的复合物称为正转录延伸因子b (PTEFb)。由Tat和TAR募集PTEFb, 可导致RNA聚合酶II的C末端发生高度磷酸化, 从而激发转录的延伸［6］。此外, 一项最近的研究表明HIV病毒基因的转录也需要介质复合体Med28的参与［2］。

2.5  HIV RNA出核转运相关的宿主蛋白  一般而言, 包含内含子的前mRNA必须在核内经过剪切才能出核。但逆转录病毒的功能蛋白只能由未剪切或部分剪切的mRNA编码, 并且病毒RNA基因也是基于全长RNA而产生的, 这就为逆转录病毒带来了很大的困难。然而慢病毒属克服了这一障碍, 它是过病毒Rev蛋白结合到一个被称为Rev反应元件或RRE的顺式作用RNA元件, 来促进未剪切或部分剪切的mRNA的出核转运。这一过程中, 细胞装置对Rev的功能发挥着决定性的作用。Rev通过把它的核定位信号结合到细胞核入核转运受体importin β上而被运入核内, 接着, Rev与核胞质转运因子Crm1相互作用, 直接参与RNARev复合体的出核转运, 同时与GTP结合的Ran GTP酶相关联。在胞质中, 当Ran结合的GTP水解为GDP时, RNARevCrm1RanGTP复合物解偶联。有趣的是, 细胞蛋白Sam68（有丝分裂中Src关联蛋白）与Rev在促进RRE介导的基因表达中起协同作用［6］。

2.6  HIV装配相关的宿主蛋白  HIV的装配和释放是由病毒的Gag母体蛋白p55Gag激发的。p55Gag是病毒核心构成成份的来源, 它在胞液中合成后, 转移到宿主细胞膜（或次级胞内体）, 并黏附在脂质双分子层上。许多细胞蛋白与病毒的Gag蛋白相结合。发生在装配过程中的蛋白包括: ATP结合蛋白HP68, 它通过结合在Gag上, 促进未成熟病毒核心的合成;  肽酰脯氨酰顺反式异构酶（CyPA）, 它通过直接与Gag蛋白衣壳（CA）区的富含脯氨酸环相互作用而结合到病毒体上。大量的研究结果表明, CA与CyPA的结合阻碍了Ref1在人类细胞中发挥感染抑制的作用, 同时却增加了Lv1在特定的非人灵长类细胞（如枭猴细胞）中发挥抗感染作用的敏感性［6］。

非蛋白类物质脂筏似乎可以促进病毒从感染细胞中释放。由于Gag是一个脂筏关联蛋白［6］, 因此Gag蛋白对脂筏的靶向作用可能会提高它与质膜的相关性, 并且可能通过与脂筏富集区的接触来促进病毒感染细胞与易感靶细胞之间的转染作用［5］。

2.7  HIV释放相关的宿主蛋白  研究表明, 在病毒装配期, Gag蛋白就已经开始将ESCRT (endosomal sorting complex required for transport, 包括ESCRTI、   ESCRTII 和 ESCRTIII）募集到存在于质膜与晚期胞内体上的出芽位点。这个募集作用是通过Gag蛋白p6结合到肿瘤抑制基因Tsg101上来实现的, 而Tsg101是出芽过程所必需的ESCRTI的组成成份。研究发现, p6Gag也可以结合到ESCRTIII 的组成成份AIP1 (apoptosis linked gene 2 interacting protein 1)上, 接着, AIP1再结合到Tsg101上。无论是p6Gag直接结合到AIP1上或是结合到AIP1与Tgs101复合体上, 都将导致ESCRTIII募集到出芽位点上。总的说来, 就是HIV募集ESCRT复合物到病毒出芽的位点上, 为其装配和释放创造了一个良好的细胞环境［6, 10］。

最近的一项研究表明, HIV的非必须调节因子Vpu与HIV的释放密切相关。如果没有Vpu, HIV病毒会被细胞的一个蛋白Tetherin（又名CD317,  BST2）吸附, 聚集在细胞表面而不能释放。Vpu能下调Tetherin的表达, 从而对抗其吸附作用而使HIV颗粒在细胞表面释放出来。

3  结语

抗HIV感染的一个很重要的策略, 就是将HIV基因编码的、 对病毒感染和复制起关键作用的蛋白作为药物靶点。然而, 这一策略面临着两个严重的问题: 一是病毒本身的多样性, 二是病毒的突变。这两大难题极大地限制了抗HIV药物的疗效。因此, 把思维由病毒转向宿主将是一个必要的选择。HIV很难对以宿主蛋白为靶点的抗病毒药物产生抗药性。因为要做到这一点, 病毒必须要进化出一种全新的能力, 而非仅仅对一个药物结合位点产生突变。以宿主蛋白为靶点的这一策略, 与在非肿瘤细胞中抑制血管生成从而达到抑制血供来避免肿瘤发生的机制相似。从HIV的生活周期入手, 自发现CD4是HIV的受体开始, 经过20多年的研究, 人们发现了多个与病毒复制相关的宿主蛋白。尤其是最近使用的全基因组siRNA筛选技术, 使人们获得了更多的HIV复制相关蛋白, 包括其中的237种人类前所未知的宿主相关蛋白。然而, 虽然人类在发现与HIV复制相关的宿主蛋白上有重大的突破, 但是, 却有更多的问题有待人们去探讨和解决。譬如, 这237种以前未知的宿主相关蛋白的作用机制都是什么？哪一些是HIV复制的限制蛋白？以限制蛋白作为抗HIV药物靶点的有效用如何？这些以宿主蛋白为靶点的药物在对感染细胞产生杀伤作用的同时, 会不会对正常细胞也造成不可弥补的损失？如何才能避免这些副作用的产生等等。

因此, 在抗HIV药物研究的征程上, 人类还有很长的路要走, 但对宿主蛋白的研究无疑给这一艰难的道路另辟了一条蹊径, 与此同时也向人类展示了它光明的前景, 尤其是CCR5受体拮抗剂Maraviroc的开发成功证明这条道路的可行性。可以预期, 在不久的将来, 这一策略将会在人类对抗艾滋病史上添加光辉的一笔。
另：
针对HIV-1在复制过程中会利用大量宿主细胞蛋白这一特点,布拉斯(Brass)等通过大规模小干扰RNA(siRNA)筛选方法在HeLa细胞系中寻找HIV-1所需的宿主因子,以揭示感染过程中HIV与宿主细胞蛋白的相互作用。
该研究发现了超过250种HIV依赖因子(HDF),并进一步阐明了部分HDF不为人知的作用,如高尔基体反转运蛋白(Rab6和Vps53)及karyopherin(TNPO3)分别在病毒进入及整合过程中发挥重要作用。
另有学者通过短发卡RNA(shRNA)筛选方法在Jurkat细胞系中分离到与病毒复制相关的254种宿主因子,但这些因子与布拉斯等发现的存在较大差异。其中46种曾被报告与HIV复制相关,而其余208种则是新发现的因子。

来源：
http://www.chinaaids.cn/n16/n1193/n4073/199496.html
参考文献】
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作者：陈敏 姜世勃 刘叔文
来源：http://journal.shouxi.net/html/q ... 0753649_485777.html