循环microRNA检测技术及分析前质量控制

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上海第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科高春芳、吴孟超在中华检验医学杂志2015年03月第38卷第03期发表题为“乙型肝炎病毒感染标志物的检测现状和思考”文章，现艾兰博曼医学网将其内容详情转载以供读者分享，以下为内容详情：

miRNA是内源性的非编码小RNA，由22～23个核糖核苷酸组成，于1993年在秀丽隐杆线虫中发现。miRNA通常来源于一个大小约为1 000 bp的长链RNA初始转录产物(pri·miRNA)，pri—miRNA分子在细胞核中经过双链RNA特异性RNase m-Drosha的作用下形成70～100 nt的具有茎环结构的RNA分子(前体miRNA)。前体miRNA在exportin-5的作用下转运至胞质中，被另一个双链RNA特异性RNaselI．Dicer识别，被进一步切割成长约22 nt的小分子RNA，即成熟的miRNA。成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)引导下与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。

miRNA存在于多种体液中，包括血浆与血清。胞外循环miRNA可以以多种不同的形式存在，如微囊泡，外来体(exosomes)，凋亡小体等，后续研究发现miRNA可与一些蛋白质结合形成复合物，如A902、核仁磷酸蛋白、LDL、HDL，这些特性都使得

miRNA具有有稳定性好，不易降解的特性。要将miRNA从分子生物实验室运用到临床，不仅需要有重复性好、结果可靠的检验系统，还需要确定分析前及分析中的影响因素并进行质量控制，包括标本采集、标本处理、RNA提取及保存。本文将对目前循环miRNA检测方法进行简略阐述，并对miRNA分析全过程的质量控制的影响因素进行探讨。

一、循环miRNA的检测方法
成熟miRNA片段小，无poly(A)尾巴，在细胞中的表达水平较低，这些特性给miRNA检测带来了困难和挑战。但是，科学家还是研究出了多种高通量miRNA检测方法，根据原理主要分为3大类，一类是基于扩增进行检测，如实时荧光定量PCR法(quantitative real．time PCR，qRT—PCR)，另一类是基于杂交技术进行检测，如microarray，还有一类是基于序列进行检测的高通量测序法，主要是指下一代测序技术(next—generation sequencing，NGS)。本文简要介绍目前普遍使用的几种检测方法。

1．qRT—PCR：qRT—PCR用于检测miRNA灵敏度及特异性好。miRNA形式多样，包括初级转录本、前体miRNA、成熟miRNA。因此，检测成熟miRNA需要高度特异性。有报道称Stem．100p法极大地提高了检测的特异性，甚至能区分出两个不同miRNA间存在的1个碱基的不同E4-51。qRT．PCR与其他方法相比，它更为快速，所需标本量少，适用标本类型范围广，如新鲜组织标本、细胞、石蜡包埋组织等川。

2．miRNA microarray：该方法能够同时检测大量miRNA，目前使用广泛。该方法特异性不及qRT—PCR，无法进行定量检测。其主要优点是较便宜，但是它的灵敏度低，动态范围窄，难以区分同源性较高的不同miRNA分子，而运用DNA锁核酸(10cked nucleic acids，LNA)会大大提高microarray的敏感度及特异度H。有许多商业化的平台用microarray检测miRNA，主要有Affymetrix、Agilent、Exiqon、Life Technologies和Illumina。Sato等对Agilent、Ambion、Exiqon、Invitrogen和Toray这5个不同microarray检测平台的重复性及可比性进行比较，并将所得结果与qRT-PCR(Taqman)结果进行比对，研究发现不同检测平台间重复性好，可比性高。此外，Sah等。对Ambion、Agilent、Exiqon及Illumina进行比较研究指出了每个检测平台的优缺点，其中Ambion与Agilent敏感性更好，而Exiqon及Illumina的特异性更好。

3．NGS：NGS主要用于发现未知miRNA，预测靶mRNA，同时也可以对标本中的miRNA表达情况进行检测。该方法与microarray相比，可进行绝对定量，能对实验结果进行直接比较，其准确率更高，与qRT．PCR结果一致性高。NGS能识别出miRNA小分子，能准确地分辨序列相似的miRNA。它不仅能够检测已知的miRNA，也可检测未知miRNA，用于发现新的miRNA，大有替代microarray的趋势。此外，NGS毕竟是一种新的技术，不及qRT．PCR和microarray成熟，且NGS用于检测基因定量表达还面临着许多挑战，如人力、物力、财力，还有用于数据分析的专业生物信息学的知识等。

4．RNA印迹法(Northern blot)：Northern blot是比较经典的检测真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法，优点是可以从大量的RNA样本中同时获得这些信息。该法的缺点是低通量，特异性和灵敏度不高，为此发展了用LNA修饰的杂交探针来取代传统DNA探针的技术116J，锁核酸能增加探针的熔解温度(Tm值)，有很强的热稳定性，对RNA有很好地识别能力和强大的亲和力，使 blot法的检测灵敏度和特异性得到显著改善。基于LNA的探针杂交技术已被广泛应用于miRNA的检测(包括原位检测)中。

二、影响miRNA检测的因素
不同的检测方法会产生不同差异，而同样的检测方法也会出现不同的实验结果，研究证明，影响miRNA检测的因素与分析前的处理密切相关，本文将从分析前的因素探讨其对miRNA检测的影响。
我们将主要讨论溶血、胞内物质、离心、抗凝物质对miRNA的影响，有学者也提到其他的一些因素，如采集血液部位，使用针筒类型，采血伤口口径，标本的储存条件等。

1．溶血对miRNA检测的影响：研究发现溶血对miRNA的检测会产生较大影响。McDonald等对内生miRNA及外源合成miRNA进行检测发现，溶血会使某些内生miRNA明显升高，外源合成的cel—miR．39无变化，Hurley等H1的研究结果发现肉眼无溶血的标本中miR．16在不同生理状况下的变异不是很大，而出现溶血时，miR．15b、miR．16均会明显升高。他们还提出将用分光光度计测定标本游离血红蛋白浓度，入=414 nm时吸光度>0．2则视为溶血，建议该标本不适合检测miRNA-3。

2．血浆或血清中的血小板及微粒对miRNA检
测的影响：许多研究发现，血浆与血清中miRNA含量并不相同，McDonald等¨列发现血浆中miRNA含量高于血清，主要原因是由于胞内成分所致(如血小板)，也可能与采血方式、采血管类型相关，为减少这种变异，建议多选用血清。Cheng等悼川对肺癌患者及健康人的血浆进行研究发现，肺癌患者血浆中血小板及微粒含量明显高于健康人，这与miRNA含量成正比。作者还提出在研究miRNA时的一些建议，如处理血浆标本后，测定PIJT数量，设定PLT阈值，超过阈值则不适合做miRNA检测，同时可以考虑进行多重离心以去除PLT及微粒对miRNA测定的影响。

3．抗凝剂对miRNA检测的影响：不同的抗凝剂对miRNA检测的影响也是不一样的。Kroh等指出EDTA和柠檬酸盐是可以接受的，而肝素则不建议使用，因为它会影响后续PCR的效率。Tiberio等旧3。对冻存的肝素血进行处理，结果显示用肝素化的血浆不会影响miRNA检测，并未发现其与K，EDTA有明显差异。而Kim等并不这么认为，他们结果显示，采血后加入NaF及KOx。能提高miRNA检测的灵敏度，NaF及KO。通过增强逆转录反应或者使抽提的RNA或cDNA稳定，而肝素化的血浆中miRNA含量明显降低。因此，使用EDTA和柠檬酸盐作为抗凝剂的标本可以接受，尽量不要选择肝素化的血浆，但对于临床使用肝素类药物或静脉注射患者血浆，只能先将其稀释，并用肝素酶处理，使用尽量纯化的RNA进行检测。

4．离心对miRNA检测的影响：血浆、血清标本中都含有或多或少的胞内物，如红细胞、白细胞、血小板及微粒，会对miRNA的检测产生一定的影响。为了消除影响，离心必不可少。Zheng等口纠分别采取一步离心和二步离心法，发现在一步离心血浆中能检测到1 284种miRNA，而经过二步离心后只能检测到206种，其中有5种只能在二步离心中检测到，有83种是只能在一步离心中检测到，但是这83种可以在二步离中的沉淀物中检测到，一步离心及二步离心血浆中的纳米微粒分布也不一样，且高速离心能减少血浆中总的miRNA含量。对于冻存的血浆、血清进行多次离心也是可以减少胞内物对miRNA检测的影响。

5．反复冻融、pH等对miRNA检测的影响：Chen等心钊对miRNA的稳定性进行深入研究发现，循环miRNA能抵抗RNA酶的降解，同时，在pH为1和13的溶液中维持3 h，与未处理组相比，miRNA的表达量并无明显差异，而经过10次反复冻融后，miRNA表达量也无明显差异。作者还验证了DNA酶对循环miRNA无明显影响，上述实验均证实循环miRNA在血浆及血清中非常稳定。

6．RNA提取对miRNA检测的影响：血浆及血清标本中都含有较高浓度蛋白质和脂质，都会对RNA提取过程产生干扰，因此RNA提取过程会极大影响miRNA检测。目前用得比较多的是用Trizol试剂提取RNA。市场上有许多商品化的RNA提取试剂盒，它们的效率不一。McAlexander等对市场上存在的几种试剂盒进行检测，包括Qiagen Kit、Exiqon Kit、Exiqon mercury及Ambion mirVana Kit，结果显示Exiqon mercury Biofluids Kit提取效果最好，加入糖原时效果更好，而Exiqon mercury及Ambion mirVana Kit的效果均不如Trizol。鉴于血浆、血清中含有的miRNA含量很少，因此在检测miRNA时会加大总RNA提取液的用量，但同时也会使来自标本或者在操作过程中(标本采集、RNA提取)带来的抑制剂含量增高。也有学者报道用Trizol及苯酚、氯仿提取RNA，用硅膜吸附可以去除标本中存在的逆转录酶与PCR的抑制剂4I。

三、miRNA检测方法的标准化

miRNA检测结果不仅与分析前的处理因素及检测方法相关，还与分析后的数据处理相关，不同的数据处理方式，得到的结果甚至完全不同，因此，miRNA检测数据结果的标准化至关重要。目前针对qRT．PCR数据标准化并没有统一标准，文献报道有多种方法，而使用不同的方法，也会使miRNA结果出现差异。

qRT—PCR最常用的方法是使用内生miRNA作内参，也可用核仁小分子RNA作为内参。有学者提出用miR一16、miR一145，但研究发现miR-16易受溶血影响，在不溶血的标本中，miR一16可作为内参，但建议在研究前对标本进行溶血判断，可在414 nm处检测游离血红蛋白吸光度，当其值<0．2时，方可将miR．16作为内参。有学者提出使用管家基因作为内参，如RNU6B、18S rRNA和5SrRNAI3．

另一种常用的方法是在RNA提取过程中，加入裂解液后，将外源合成的miRNA(如Cel-miR一39、cel．miR-54、cel—miR．238)加入标本中，将这种外源合成的miRNA作为qPCR的标准质控。33。34o，它可以用于监测RNA提取效率。将这种外源加入miRNA与内生miRNA作内参相结合起来是一种比较理想的标准化操作。

也有学者提出用Ct平均值及总蛋白所含囊泡量作为标准质控旧5I。而对于大规模miRNA谱数据，建议使用miRNA表达综合评分法进行数据标准化，主要用来纠正不同标本处理过程中所产生的技术误差‘28I。Mestdagh等指出，与使用内生小miRNA(如核仁小RNA)方法相比，在生物因素不变的情况下，这种方法能更好地消除技术误差。

总而言之，为了得到较准确的结果，可以采取多种方法进行数据标准化，如采用内生miRNA作内参，同时用外源加入miRNA作外参。

四、展望

随着对循环miRNA深入研究发现，循环miRNA较稳定，参与基因调控和多种疾病的产生，但是仍然有许多miRNA的功能和机制并不明确。miRNA属于新的领域，miRNA研究的方法学及早期检测仍存在较多问题，它能否作为肿瘤标志物应用于临床也还需要大量研究证明，而随着标本处理、内参基因选择、数据标准化及miRNA检测技术等的标准化，miRNA检测在临床疾病的诊断及预后中势必起着重要作用。