【转移贴】转基因动物模型建立“乙肝小鼠”成人类替身

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原帖由一米阳光 发表于 2008-10-13 13:27

信息来源：文汇报　更新时间：2005-8-1
《文汇报》2005年7月28日讯：八辈子不知道乙肝为何物的小鼠，在转基因技术的帮助下，变成了“乙肝病毒携带者”！别担心，这不是在制造实验室鼠疫，而是我国科学家为了更深入地研究乙肝，专门培养的“动物替身”。

复旦大学医学院闻玉梅院士昨天告诉记者：目前新一代持续表达乙肝病毒表面抗原的转基因小鼠已稳定繁殖了7代。这一动物模型的建立，对研究和治疗我国为数巨大的乙肝病毒携带者具有重要意义。

转入“中国特色”的乙肝病毒基因

人会得乙肝，动物却很难。研究人员介绍，除了身价不菲的黑猩猩，绝大多数动物都不会感染这种病毒。为此，科学家一直在想方设法寻找合适的“动物替身”，用以模拟人类乙肝患者。

在闻玉梅院士的带领下，复旦大学与南方模式生物研究中心决心另辟蹊径。在几百枚小鼠的受精卵细胞内，课题组“植入”了乙肝病毒基因组。20天后，经过筛选的鼠宝宝呱呱落地，成为天生的“乙肝病毒携带者”。

课题组成员任军博士告诉记者，乙肝病毒分为7种不同亚型，我国以B型、C型居多。此次转入小鼠体内的，正是从我国乙肝病毒携带者体内分离出的一株B型病毒的基因。

“人类替身”享受贵宾待遇

在南方模式生物研究中心的实验室，记者见到了这群探头探脑的“小煤球”。看起来，它们可不像一群“病人”，而是个个活泼可爱：黑色“板寸”，两片花瓣耳，粉嫩光溜的长尾巴。据研究人员介绍，这群小鼠已是乙肝病毒转基因“世家”的第7代“鼠孙”，现有400余只。

一沾“转基因”的光，连小鼠也享受起贵宾礼遇：卧房的温度、湿度、日照、通风都有严格标准。还有特殊工艺木屑铺就的一床“席梦思”，以及专享的饼干和“自助餐”。

南方模式中心副主任费俭研究员说，这群小鼠“患者”的乙肝病毒表面蛋白(即常说的“表抗”)表达稳定，较好地模拟了乙肝病毒携带者的状态。再加上它们繁殖力惊人，出生后40天即可交配繁殖，因此完全能充当“取之不尽”的人体实验代用品。

目标：研究1.2亿乙肝病毒携带者

在求学、就业过程中碰壁，在生活中受歧视，部分患者最终发展为肝硬化、肝癌——闻玉梅院士告诉记者，目前我国约有1.2亿乙肝病毒携带者，数量十分庞大。

与活动性乙肝病人不同，在携带者的体内，乙肝病毒会悄悄“潜伏”。为什么潜伏状态的病毒却能在人体内长时间制造大量的乙肝病毒表面蛋白？这是否会直接或间接导致肝细胞的癌变？这一切的内在机制又是怎样？可否找到其中的关键环节并人为地施加影响(治疗)，彻底清除潜伏的病毒？所有这些问题，都需要转基因小鼠在研究工作中“大力协助”。

闻玉梅院士说，借助动物模型，科学家就能“推鼠及人”，系统探索相关发生机理，寻找乙肝病毒携带者的治疗良药。此前，闻玉梅课题组已经研制出我国第一个乙肝治疗性疫苗，“现在，我们要把关注对象从活动性乙肝患者扩展至乙肝病毒携带者”。

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乙肝病毒感染模型研究新进展

陶鹏    黄爱龙

【关键词】    肝炎病毒，乙型；  细胞模型；  动物模型

The  latest  progresses  of    HBV  infection  models.  TAO  Peng,  HUANG  Ai-long.

【Key  words】        Hepatitis  B  virus  ;  Cell  model;    Animal  model

【First  author抯  address】        Institute  for  Viral  Hepatitis,  Chongqing  University  of  Medical  Sciences,  Chongqing  400010,  China   

           

　　病毒性肝炎抗病毒药物的开发和评价中的重要环节之一就是建立一种方便有效的体内外模型。现就乙型肝炎的感染模型新进展作一简要综述。

一、体外模型

　　乙型肝炎病毒（hepatitis  B  virus，HBV）感染有高度的种属和组织特异性，它只感染人和类人猿。其原因是病毒黏附以及病毒DNA转录及复制对细胞有严格的要求[1]。体外培养的人和类人猿原代肝细胞可以支持HBV的复制，但细胞维持时间不长。能在体外长期培养的肝源性肿瘤细胞株2.2.15是应用最广泛的乙型肝炎细胞模型。将含有HBV基因组（２个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联）的重组载体质粒转染HepG2细胞，经G418筛选，得到的克隆能稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒，可检测到细胞内DNA和RNA，但无cccDNA。2.2.15细胞模型存在的问题是：HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；病毒复制的水平不能人为改变；病毒复制水平低。为克服HBV的细胞膜屏障，人们借用其他病毒的感染能力，把HBV导入到靶细胞。Delaney等[2]报道了一种抗HBV药物体外筛选系统，即HBV-杆状病毒-HepG2系统。利用杆状病毒Autographa  California将具有复制能力的HBV基因组导入到HepG2细胞，检测到高水平的HBV表达，包括细胞内和细胞外HBV  DNA和RNA，以及cccDNA和各种HBV抗原。病毒表达的水平和病毒的感染量（MOI）有量效关系。该系统可以控制感染的时间，在病毒复制期间或之前对细胞进行处理。用该系统对拉米夫定的药效进行评价，发现拉米夫定可以减少细胞内复制中间体和细胞外HBV  DNA,而且可以抑制cccDNA的表达，这在以前的系统中是不能观察到的。拉米夫定的作用有剂量和时间依赖性[3]。他们还用此模型检测了药物对HBV变异株的作用[4]。但是，杆状病毒系统也有缺陷：(1)  杆状病毒进入哺乳动物细胞是通过非特异的内涵体摄取而不是受体介导方式；(2)杆状病毒感染的每个细胞内有多个HBV拷贝；(3)杆状病毒介导的基因转移限制在一定的种属，更重要的是不能作为动物体内实验的方法。He等[5]采用Ad-HBV1.3-HepG2系统以腺病毒为载体，将1.3倍的HBV转入包装细胞，再将包装好的病毒感染HepG2细胞，可以产生高水平的HBV表达。该系统利用细菌内同源重组法[5]，将具有同源性的两个质粒pAdEasy和pAdTrack-CMV共转化E.coliBJ5183细胞，使腺病毒载体和目的基因HBV1.3连为一体。HBV1.3除含完整HBV基因组外，在5′端还多余一段HBV序列，即ENHI和ENHII,X  ORF.Poly  A[1]。转基因小鼠实验证实HBV1.3比HBV1.1和HBV1.2更高地表达HBV[6]。质粒pAdEasy含有不完整的腺病毒Ad5基因，缺失E1区(1-3533)和E3区(28130-30820)，E1区对于病毒复制是必需的，293细胞可以补充E1区。质粒pAdTrack-CMV含有目的基因HBV1.3,CMV  启动子，绿色荧光蛋白基因（GFP），卡那霉素Kan,Pacl位点，pmel位点，在pmel两侧分别为两臂，左臂含Ad5第34931-35935核苷酸，右臂含Ad5第3534-5790核苷酸，两臂介导和pAdEasy的同源重组。将pAdTrack-CMV用pmel酶线性化后，和环状的pAdEasy共转化E.coliBJ5183细胞，利用卡那霉素抗性筛选重组体，再用限制酶  pacI.speI.BamH1消化证实；重组成功的质粒用pac1线性化，然后用脂质体法转染包装细胞293(人胚肾细胞)。观察绿色荧光蛋白的表达，可以计算转染的效率。用获得的病毒颗粒重复感染293细胞，进一步扩增病毒。  当病毒的滴度达到108～109时，用合适的MOI感染HepG2细胞。用Southern  blot和nothern  blot检测细胞内外的HBV复制中间体。该载体具有以下优点：(１)含有大部分腺病毒基因组序列的腺病毒骨架质粒，于超螺旋形式应用而不需要进行酶切处理；(２)重组是在具有高效同源重组机制的细菌内进行而不是哺乳动物细胞内，省掉了连接的步骤；(３)可以插入达10kb的目的基因，而且可以在同一病毒内插入多个基因；(４)腺病毒骨架质粒上整合了绿色荧光蛋白基因，可以直接观察转染和感染效率，使得腺病毒监测问题变得更容易[5]。Sprinzl等[7]利用AdHBV1.3，将293细胞包装好的病毒感染数种原代肝细胞和HepG2细胞，获得成功。分别用Ad-HBV1.3感染人原代肝细胞，小鼠肝细胞，大鼠肝细胞，树鼠句肝细胞，以及鸭肝细胞和HepG2细胞，应用Southern杂交检测出细胞内HBV  DNA，cccDNA,用northern杂交检测到3.5kb、2.4kb和2.1kb的HBV  RNA。用western  blot  检测到HBV各种抗原。应用斑点杂交方法检测到培养基或血清中的HBV颗粒。该系统使HBV可以感染跨种的多种细胞，包括小鼠，大鼠，树鼠句肝细胞，甚至包括禽类的鸭肝细胞。以DHBV代替HBV也能得到相似的结果。和2.2.15系统相比，它具有高效转移、表达HBV，可对HBV突变和表达进行人为控制等优点；和杆状病毒系统相比，它不存在种属障碍，可以用做体内实验，而且表达水平更高。

二、体内模型

　　类人猿和黑猩猩作为HBV感染模型已得到公认，但价格昂贵，难以推广。土拨鼠肝炎病毒（WHV）慢性感染的土拨鼠可以发展为严重的肝炎和肝肿瘤，和人感染HBV后的发病过程非常相似。给新生的土拨鼠接种WHV,  可获得慢性WHV感染土拨鼠模型。慢性WHV携带的土拨鼠平均寿命为29个月，最后几乎全部都发展为肝肿瘤。土拨鼠还可作为抗病毒药物临床前评价的工具，研究药物的药效、药物动力学以及毒理，也可用作评价免疫治疗的疗效[8]。用土拨鼠的局限是：它们感染的肝炎病毒为WHV，和HBV有一定差异，使对乙型肝炎的发病机理和机体应答的研究受到限制。研究发现树鼠句可以感染HBV，严瑞琪等[9]发现HBV感染树鼠句HBsAg血症者47%，平均持续7周，HBV  DNA阳性率51%，持续41周以上；肝细胞HBV  DNA阳性率67%，并存在复制型HBV  DNA。用感染HBV树鼠句的血清可连续传代感染。但国外报道有所不同，将新生树鼠句和成年树鼠句腹腔接种HBV阳性患者的血清，都在血清中检测到HBsAg,2～4周后血清中检测到抗HBs,抗HBc，抗HBe，而HBsAg消失，类似急性肝炎的病程。说明在树鼠句感染HBV是一过性的，HBV的复制和表达水平不高。

　　Sprinzl等[7]利用Ad-DHBV1.3系统，将293细胞包装好的病毒颗粒以尾静脉接种小鼠，5d后处死小鼠，8只小鼠中有7只肝脏中用Southern  blot检测出复制型DHBV,用PCR检测出所有小鼠的血清中有DHBV,都没有腺病毒DNA。用这些鼠的血清可以感染原代鸭肝细胞，并且和DHBV阳性鸭的血清感染效率相当。说明DHBV也可以通过腺病毒转移到小鼠肝脏并支持DHBV体内复制。近年来HBV转基因小鼠受到重视。将HBV目的基因显微注射到小鼠的受精卵，产生稳定整合HBV的小鼠。在目的基因的选取上，可以是HBV全长或超过其基因组的1.3倍HBV，也可以是HBV片段，如前s、s、c和x基因，用于研究各基因及其表达产物在HBV生活史中的作用。HBV转基因小鼠不仅可以研究HBV感染过程和感染后的免疫病理改变[10]，还有助于发展新的抗病毒治疗方法。HBV转基因小鼠实验发现在慢性HBV携带者由于一种抗原提呈细胞（树突状细胞）的功能缺陷和缺乏一些必要的细胞因子，不能有效提呈HBsAg,不能清除病毒，导致持续感染[11]。但是在所有的HBV转基因小鼠都不能检测到细胞内cccDNA,  而cccDNA是前基因组及各种长度RNA的转录模板，在HBV的复制过程中起着非常重要的作用，而目前抗病毒治疗主要是在反转录和复制水平抑制病毒DNA，而且HBV是整合在宿主染色体上的，没有经过和靶细胞受体结合穿透的过程，与自然感染不同，应用也受到限制。

　　为克服转基因鼠的缺陷，人们寻求一种模拟HBV自然感染的动物模型。Dandri等[12]将UPA转基因小鼠和RAG-2基因剔除小鼠杂交，得到的后代被移植入人肝细胞。由于UPA是一种纤维蛋白酶原激活剂，它选择性地在肝细胞表达，使肝细胞中的蛋白质水解，造成UPA小鼠体内肝细胞持续损伤，产生肝再生刺激信号，有利于外源肝细胞的存活。而RAG-2基因剔除小鼠由于缺失重组活化基因RAG-2,T细胞和B细胞不能成熟，不具备完整的体液和细胞免疫功能，对外源肝细胞不排斥。二者杂交的后代兼有以上两种特征，可以支持HBV感染和表达。实验中采用脾内注射人肝细胞悬液，在小鼠血清和肝脏中均检测到HBV各种抗原和复制中间体。该模型可以用于HBV感染过程和治疗的研究，以及肝癌的发生机理，但因采用的是免疫缺陷鼠，不能作为机体和病毒相互作用特别是免疫清除机理的研究。另外，人肝细胞移植的效率很低，只占小鼠肝脏的15%，而采用同样的方法移植土拨鼠肝细胞，则可占小鼠肝脏的90%以上，可能和移植肝细胞的活力高低有关。

　　从已有的HBV体内外模型看来，Ad-HBV1.3-HepG2系统是较为理想的，可以用做体内体外实验，研究HBV的生物学，判断抗乙型肝炎药物及其他治疗手段的疗效，但是不能用作研究病毒黏附，致癌机制等。HBV体内体外模型还需要进一步探索。

参    考    文    献

1Tang  H,  McLachlan  A.  Transcriptional  regulation  of  hepatitis  B  virus  by  nuclear  hormone  receptors  is  a  critical  determinant  of  viral  tropism.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA,  2001,  98:  1841-1846.

2Delaney  WE,  Isom  HC.  Hepatitis  B  virus  replication  in  human  HepG2  cells  mediated  by  hepatitis  B  virus  recombinant  baculovirus.  Hepatology,  1998,  28:  1134-1146.   

3William  E,  Delaney  IV,Thomas  GM,  et  al.  Use  of  the  hepatitis  B  virus  recombinant  baculovirus-HepG2  system  to  study  the  effects  of  (-)-β-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine  on  replication  of  hepatitis  B  virus  and  accumulation  of  covalently  closed  circular  DNA.  Antimicrob  Agents  Chemother,  1999,  43:  2017-2026.     

4Delaney  WE,  Edwards  R,  Colledge  D,  et  al.  Cross-resistance  testing  of  antihepadnaviral  compounds  using  novel  recombinant  baculoviruses  which  encode  drug-resistant  strains  of  hepatitis  B  virus.  Antimicrob  Agents  Chemother,  2001,  45:  1705-1713.

5He  TC,  Zhou  S,  Da-Costa  LT,  et  al.  A  simplified  system  for  generating  recombinant  adenoviruses.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA,  1998,  95:2509-2514.

6Guidotti  LG,  Matzke  B,  Schaller  H,  et  al.  High-level  hepatitis  B  virus  replication  in  transgenic  mice.    J  Virol,  1995,  69:  6158-6169.

7Sprinzl  MF,  Oberwinkler  H,  Schaller  H,  et  al.  Transfer  of  hepatitis  B  virus  genome  by  adenovirus  vectors  into  cultured  cells  and  mice:  crossing  the  species  barrier.  J  Virol,  2001,  75:  5108-5118.

8Tennant  BC,  Gerin  JL.  The  woodchuck  model  of  hepatitis  B  virus  infection.  ILAR  J,  2001,  42:  89-102.

9严瑞琪，苏建家，黄定瑞，等.  人乙型肝炎病毒在树鼠句的实验感染及其与肝癌发生的关系.  中山医科大学学报，1995，16：1-5.

10Walter  E,  Keist  R,  Niederost  B,  et  al.  Hepatitis  B  virus  infection  of  tupaia  hepatocytes  in  vitro  and  in  vivo.  Hepatology,  1996,  24:  1-5.

11Guidotti  LG,  Borrow  P,  Hobbs  MV,  et  al.  Viral  cross  talk:  intracellular  inactivation  of  the  hepatitis  B  virus  during  an  unrelated  viral  infection  of  the  liver.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA,  1996,  93:  4589-4594.

12Dandri  M,  Burda  MR,  Torok  E,  et  al.  Repopulation  of  mouse  liver  with  human  hepatocytes  and  in  vivo  infection  wth  hepatitis  B  virus.  Hepatology,  2001,  22:  981-988.



(收稿日期：2002-09-18)

(本文编辑：金生)

作者单位：400010  重庆医科大学病毒性肝炎研究所   

陶鹏  29岁，住院医师，在读博士研究生，从事病毒性肝炎发病机理及治疗研究。
www.biotech.org.cn/news/news/show.php?id=25604

HBV转基因小鼠对药物研究有重要作用,国内的治疗性乙肝疫苗均有使用.

HBV转基因小鼠对药物研究有重要作用,国内的治疗性乙肝疫苗均有使用. 有cccDNA的形成.

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一米阳光 发表于 2008-10-13 13:41
广州研究出内地唯一能应用的乙肝转基因小鼠     

中新社广州2002年5月22日电(王华聂长江)广州空军医院近日研究出乙肝转基因小鼠，为人类攻克乙肝提供了具有实用价值的动物模型，成为目前中国内地唯一能供给应用的乙肝转基因鼠。

据负责该项研究的熊博士介绍，由于乙肝病毒仅感染黑猩猩和人类，而黑猩猩来源有限，又不能用病毒感染人体实验，令科学家们研究乙肝病毒十分困难。乙肝转基因鼠将乙型肝炎病毒安置到小鼠基因组上，造成人为感染并代代相传，形成能产生乙肝病毒的小鼠品系。这类转基因小鼠解决了科研中缺乏动物模型的难题，对乙肝新药开发、药物筛选及乙肝治疗研究具有重要作用。

据了解，该项研究还在建立转基因动物方法上取得突破，独创精原干细胞体内转染法为国际首创，既简便又降低了实验成本。

目前所培育出的转基因小鼠已到第八代，全身各部分细胞都有病毒基因，表达性强，能批量生产并已供中科院等二十多家机构使用。该中心还将进一步进行其它种类的转基因动物研究。



        亚某国立医科大学专程派人来到广州空军医院，参观了该院转基因实验室，当场签订了100只HBV转基因小鼠供货合同。这是因为该院研究生产的HBV转基因小鼠不仅达到国内领先水平，部分技术甚至达到国际先进水平。   

        鉴于人类感染乙型肝炎病毒（HBV）情况非常严重，攻克HBV是各国医学科学家重点研究的课题。然而，研究首先遇到的难题便是选择动物模型。因为乙型肝炎病毒只能感染人类与黑猩猩，人类不能用自己做实验，而黑猩猩来源又十分有限。1985年开始，科学家们开始研制HBV转基因小鼠，1998年后在几个发达国家中开始成熟。所谓HBV转基因小鼠就是人为地将乙型肝炎病毒基因安置到小鼠的基因组上，让乙型肝炎病毒在小鼠体内生存，并代代相传，形成一个能产生乙型肝炎病毒的小鼠品系。这类小鼠是研究乙型肝炎的病因、发病机理及防治，特别是药物筛选、疫苗验证的理想动物模型。   

        据该院全军肝病重点实验室转基因工作研究室主任医师熊一力介绍，目前国内能建立HBV转基因小鼠的实验室屈指可数，能供给他人应用的几乎没有。该院研究出HBV转基因小鼠非常“纯正”，全身每个部分所有细胞都有HBV基因，达国内先进水平，获军队科技进步二等奖，其中技术―――精原干细胞体内转染法更达到国际先进水平。现在，技术操作已基本成熟与完善，已能批量生产供应给各研究单位。