Nature Methods：2016年最值得关注的八大技术

Biodog

《Nature Methods》盘点2015年度技术，选出了最受关注的技术成果：单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）技术。 除此之外，也整理出了2016年最值得关注的几项技术，分别为：细胞内蛋白标记（Protein labeling in cells）、细胞核结构（Unraveling nuclear architecture）、动态蛋白质结构（Protein structure through time）、精准光遗传学（Precision optogenetics）、高度多重化成像（Highly multiplexed imaging）、深度学习（Deep learning）、亚细胞结构图谱（Subcellular maps）和综合单细胞图谱（Integrated single-cell profiles）。

1、新蛋白标记

荧光化学染料相对较小，具有很好的光物理性质和光谱跨度。这些特性使荧光染料特别有吸引力，有望替代荧光蛋白进行蛋白标记。研究者们正在积极开发相应的工具，在活细胞中用染料标记目的蛋白。

对于绝大多数应用来说，荧光染料需要能够实现特异性的标记。现在已经有一些工具能做到这一点，比如SNAP和Halo标签、FlAsH和ReAsH、和hexahistidine标签。这些工具主要使用能特异性结合相应染料的小蛋白或多肽，对靶蛋白进行标记。还有一种方法是在蛋白翻译过程中掺入非天然氨基酸，这些非天然氨基酸本身就发荧光，或者可以通过点击化学（click chemistry）发出荧光。

虽然这些方法越来越受欢迎，但它们也遇到了一些问题。举例来说，荧光染料在多重成像中用处有限，能跨越活细胞膜的染料标记效率低、数量少、质量差。这类染料的开发目前是一个相当活跃的研究领域。毫无疑问，未来人们将大大增强荧光染料的标记效率，这会进一步提高定量成像的能力。可用染料将得到显著改进，这会增加多重化，减少成像所需的光。全新的蛋白标记方法也将出现在人们眼前。

特异性蛋白标记有助于在固定细胞和活细胞中进行超高分辨率成像。当分辨率接近几十纳米的时候，标记造成的问题就会凸现出来。举例来说，用抗体进行标记会使目标结构增加约10nm，而二抗会进一步增大检测目标。为了解决这一问题，不少研究者正在开发纳米抗体（nanobodies）。纳米抗体是来自骆驼的小抗体片段，是人们用基因工程方法克隆骆驼重链抗体可变区得到的单域抗体。与传统IgG抗体相比，纳米抗体具有分子质量小、容易生产、稳定性好、抗原结合力高等特点。

我们相信，新的一年会有更多更好的蛋白标记策略涌现出来，让显微成像登上一个新的台阶。

2、细胞核结构

“位置高于一切”是房地产的金科玉律，这句话也同样适应于哺乳动物基因组。基因调控依赖于染色质及其调控元件在细胞核内的三维组织形式。染色质构象捕获的经典方法（3C），让我们对染色质的复杂结构有了惊鸿一瞥。但要在高分辨率和高通量水平上成像3D染色质结构的动态，我们还需要新的方法。这些方法将帮助我们真正理解基因组的组织形式，这种形式随时间推移的演化，及其对疾病的推动作用。

3C衍生技术主要是将相互作用的染色质位点交联起来，然后再进行扩增和测序。这种技术的通量受到了限制，而且对顺式互作有偏好。最新的技术改良包括两个连续的捕获步骤，不仅大大提高了通量和分辨率，还能实现弱互作和强互作的相对定量，阐明它们各自的生物学作用。（Nat. Methods 13, 74–80, 2016）

要想全面把握细胞核结构的动态，把群体数据与单细胞数据结合起来是很重要的。这就需要覆盖基因组学、生物物理学和显微成像的综合性方法。美国NIH最近资助的4D细胞核组学计划（4D Nucleome Program）就是一种这样的尝试，该计划希望结合多方面力量获得基因组结构图谱，在高分辨率水平上成像和研究亚细胞核区域。研究者们正在进一步改良实验和计算方法，以适应单细胞的核组分析。

一旦细胞核结构分析成为更为常规的定量程序，我们将能更好的预测突变（不论是与疾病有关的突变还是在基因组编辑时引入的突变）对基因调控的影响，以及突变的作用机制。我们甚至能特异性改变基因组结构，给细胞带来我们想要的改变。

3、动态蛋白质结构

动态蛋白质结构（Protein structure through time）分析技术主要指的就是时间分辨晶体学技术（time-resolved crystallography），这种技术在2014与2015年间多次出现在Nature，Science两大顶级期刊中，取得了许多重要的进展，令科学家们可以观察到快速蛋白结构的变化。

蛋白静态结构能帮助生物学家了解其功能，但研究人员还希望能观察到蛋白的动态变化，然而要想检测瞬时中间构象并不是件容易的事。

分析蛋白质动态变化可以采用的一种方法：时间分辨X射线晶体技术 (TRX)。这种方法利用激光“泵”脉冲启动一个反应，然后X射线“探测”到脉冲，收集一系列随着反应发生的衍射图样。

过去要完成这样的实验需要非常专业化的激光同步源，而且这些设备存在“限速”——约100 皮秒。现在近期技术进展能通过超快X 射线自由电子激光 (XFELs)，来提供飞秒级的时间分辨率，允许研究人员观察非常迅速的结构变化。

2014年，亚利桑那州立大学等处的研究人员就利用SLAC国家加速器实验室世界上最强大的X射线灯，获得了光系统II(photosystem II)将水分解为氢和氧时这一分子复合体的第一批成像图片。这一研究成果公布在Nature杂志上。

利用直线加速器相干光源LCLS（Linac Coherent Light Source），研究人员监测了光系统II复合体分子结构的改变，分辨率达到5.5Å。LCLS只提供30飞秒的照射时间，短到可以在不同的阶段定格水分解过程。

之后另外一组研究人员用X射线激光器以慢动作的形式展示了一个光敏性生物分子的快速动态。研究成果公布在Science杂志上。

研究人员将PYP蛋白（photoactive yellow protein）作为模式系统，PYP是一种蓝光感受蛋白，在特定细菌的光合作用中起作用。PYP蛋白捕获蓝光光子之后，会经过一系列中间结构获得光子的能量，然后再回到初始状态。PYP光循环的绝大多数步骤已经被人们研究过了，是验证新方法的理想模型。为了获得PYP的动态快照，研究人员制造了微小的PYP晶体，这些晶体的直径大多小于0.01毫米。他们在LCLS（目前最强的X射线激光器）系统中喷射这些微晶体，并用精确同步的蓝光脉冲启动它们的光循环。LCLS生成了极短极密集的X射线快照，捕捉到了PYP在光循环不同阶段的形态改变，分辨率达到了前所未有的0.16纳米。随后研究人员将自己获得的快照组成视频，展示了慢动作的PYP光循环。

同年，来自英国利兹大学的研究人员详细描绘了这种技术，他们指出这种新方法采用了clever maths（一种Hadamard转换），帮助科学家们利用强大的同步辐射光进行结晶或其它技术，从而完成时间分辨晶体学研究。

2015年同样发表在Science杂志上的一篇文章中，一组研究人员又利用超快XFEL脉冲，解析了肌红蛋白铁离子光解活性部位血红素二氧化碳键的结构变化。

未来一定还会有越来越的相关成果，我们期待这一技术在2016年的发展。

4、精准光遗传学

时间往回拨五年，2010年Nature Methods的年度技术就是光遗传学（optogenetic）。光遗传学是由斯坦福大学的研究人员开始用于研究小鼠大脑的，他们将这项技术称之为Optogenetics(optical stimulation plus genetic engineering 光刺激基因工程/光遗传学)。经过这么几年的发展，光遗传学已经在细胞分辨率水平上实现了对神经元的操控，从而为实现神经微解剖走出了第一步。

在十年前光敏感通道ChR2（Channelrhodopsin-2）就被引入了神经生物学领域，这种强大的工具经证明不仅能用于刺激神经元，而且也能用作其它光遗传学工具。这些工具用途广泛，尤其适用于遗传定义神经元的表达，但科学家们需要的是更加详细的神经回路信息，因此还需进一步探索模式照明方式，操控神经元亚群活性。

几种方法能获得光照模式，比如快速扫描镜（fast scanning mirrors，生物通译），计算机生成全息模式都能作为空间光调制器。此外，照明方式也需要与神经元活性光学输出组合起来，但这并不容易，由于要求光遗传激活剂与活性传感器之间的光交流，因此需要多重优化。

近年来也取得了一些成果，如发表在Nature Neuroscience杂志上的一项研究表明，通过双光子激光，快速扫描镜对不同神经元进行归总和开启，可以实现接近同时的神经元照明。

还有来自伦敦大学学院的研究团队使用两种尖端技术发现了解大脑是如何工作的新途径，他们为了能够读出神经细胞的活动，基因编码神经细胞传感器使得其在激活时就能发光。同时为了能够控制神经细胞的活动，研究人员在这些神经细胞设计表达光敏蛋白，使得其能被光闪激活。

重要的是，这篇文章找到了一种方法可以同时激活多个脑细胞：通过全息技术，研究人员把一束光分成更小的子光束从而选择性靶向单个脑细胞。

在这两项研究中都采用了一种红移峰（red-shifted，生物通译）光遗传执行元件：C1V1减少绿色钙离子指示剂（报告神经活性）之间的光交流。此外，在无行为动物中，纤维内窥镜（fiberscopes）也可以通过传递单光子照明实现相同的模式。

细胞分辨率水平的光遗传学未来将能促进我们对多种神经元亚群分类和功能的了解，不过这些方法迄今为止只能在单一二维平面上刺激神经元，而神经元实际上是在大脑三维环境中进行交流和完成功能的。将光遗传学扩展在三维空间，也许就能打开神经元功能研究的另一扇大门。

5、高多重成像

荧光团之间的光谱重叠，是成像复杂生物学结构的一个主要障碍。这种限制让绝大多数实验只能检测三、四个靶标。我们怎样才能看到一个多彩的细胞呢？多重成像可以做到这一点。多重成像能在更有意义的环境中观察分子，更好地分析多成分复合物的形成和改变。这种技术终将转变我们对生物学过程的理解。

为了解决多重成像目前面临的问题，人们正在开发更好的探针。比如跨越可见光区和不可见光区的探针，这些探针可以带来更多的颜色选择。还有一种称为intracellular laser的探针，它们的光谱很窄，比较容易区分开。这些探针方面的改进，有助于用标准显微镜实现更好的多重成像。

此外，研究者们还在开发光学装置来检测光谱重叠的荧光团。举例来说，华人学者Ke Xu及其同事搭建了SR-STORM显微镜（spectrally resolved stochastic optical reconstruction microscopy），通过真彩超高分辨率显微成像获得每个标签分子的光谱和位置信息。这一方法能够轻松辨别光谱高度重叠的荧光团，为人们打开了多靶标成像的大门。

高度多重的免疫荧光成像技术也在不断涌现。研究者们先用抗体标记一组靶标，并且进行成像。然后漂白或剥除探针，再以同样的方式标记不同靶标。反复多轮标记之后就能建立起高多重图像。华裔学者蔡龙通过这样的策略完成了高多重转录组成像，在多轮成像之后利用独特条码鉴定不同的转录本。

庄小威实验室开发的单分子成像技术MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization），是一种高度多重化的smFISH成像方法，可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位，打破了之前的技术局限。

虽然上文提到的方法都很强大，但活细胞多重成像仍然需要方法改良。活细胞与固定细胞的多重成像有相同的问题，但也面临着一些特别的挑战。举例来说，活细胞可用的荧光染料和探针比较少，需要快速图像获取，而且对光照敏感。

相信在不久的将来，人们会开发出大规模多重成像的实用策略，进一步探索细胞中发生的生物学过程。

6、基因组分析深度学习

功能强大的机器学习能力令计算器开始解决了一些感性问题，如图像和语音识别，而这也越来越多地被应用到了生命科学领域。这些深度学习技术，比如人工神经网络可以利用多重处理层检测庞大数据库中的模式和结构。

这其中的每一层都会从构建的上一层数据中学习到一个概念，越高层，学习概念越抽象。深度学习并不取决于事先的数据处理和自动提取特征。用一个简单例子来说明：一个任务为形状解释的深度神经网络，其第一层是识别简单的边，然而在之后的层中增加更加复杂的形状（由这些边组成），有多少层并没有什么硬性规定，但是大多数专家人物构成深度学习起码要超过两层。

近期一些研究展示了深度学习的作用，这种技术能单单根据DNA序列，就能衍生出基因组中的调控特征，如今年发表在Nature Methods杂志上的一篇文章指出，DeepSEA 可以输入基因组序列，串联出大规模项目（如ENCODE和表观遗传学路线等）的染色质图谱，预测出一些重要调控位点的单核苷酸变异的影响，这些调控位点包括脱氧核糖核酸酶DNase敏感位点，转录因子结合位点，和组蛋白标记位点等。

另一个方法：Basset 则能利用相似的深度神经元网络，预测单核苷酸多态性对染色质可接近性的影响；还有 DeepBind 能发现RNA与DNA上的蛋白结合位点，预测突变的影响。

深度学习能从非常庞大的数据库中挖掘到高水平信息，因此将在大数据分析中大显身手。特别是对于基因组分析，可以解决由于训练数据缺失依赖性和计算成本高造成的诸如过度拟合（overfitting）等问题。学术机构，还有一些新公司（如Deep Genomics）的研究人员去年发起了一项活动，倡导利用深度学习分析基因组，其目的在于预测遗传变异的影响——包括自然发生和由基因组编辑引起的变异，解析这对细胞调控的影响，以及由此引发的对疾病发展的影响。

7、蛋白定位亚细胞图谱

早在几个世纪之前，我们人类就开始绘制地球，海洋和天空的地图了，然而直到近几十年，我们才开始在分子水平上探索细胞的图谱奥秘。

细胞结构严密，不只是细胞质，细胞内的各个成分均组织紧密整合。这些成分构成细胞器，具有特殊的分子组成和特性，而且它们也随着不断分子流入与流出，保持着动态平衡。毫无疑问，细胞功能进程依赖于其结构：细胞筛选通过一系列膜结构，许多信号过程也是通过分子支架进行组织的，还有基因表达也与基因组的空间构成有关。虽然细胞组织和蛋白定位可以通过细胞生物学解析，但是其中对蛋白分布进行系统分子绘图依然有待研究。

早期的研究工作利用细胞分馏，进行蛋白定位生化分析，主要采用的技术是质谱（Cell 125, 187–199, 2006），而近年来科学家主要采用基于抗体的免疫细胞化学方法等技术绘制亚细胞结构图谱，其次还有遗传编码工具，如抗坏血酸过氧化物酶，生物素连接酶，这些都可以用于基于接近感测（proximity-based methods）的生物素化分析方法，还有捕获与质谱技术，也能确定细胞内靶向位点上存在哪些蛋白。

麻省理工学院的研究人员利用显微镜成像和质谱法，标记了细胞特异区域中的蛋白质，生成了一张该区域中所有蛋白质的综合列表（Science 339, 1328–1331, 2013）。

他们在质谱法之前先标记活细胞中的蛋白质，从而在细胞裂解之前先获得了空间信息。随后在分析过程中通过注释携带定位标记的蛋白，对这一信息进行重建。新系统利用了一种生物素（biotin）化学标记。为了用生物素标记蛋白质，研究人员首先设计出了一种命名为“APEX”的新酶。

该酶是一种过氧化物酶。每种过氧化物酶都具有不同的底物，生物素酚（biotin-phenol ）是APEX的一种底物。当研究人员将生物素酚添加到表达APEX的工程细胞上时，该酶生成了生物素-苯氧自由基(phenoxyl radical)——带有不成对电子的高活性分子。这些自由基迅速抓取附近的蛋白质，用生物素对它们进行标记。

这些方法也在不断改进中，而且也开始被应用于亚细胞结构图谱实验。如一些开发的定位程序，WoLF PSORT就是用于蛋白质亚细胞定位预测的PSORT II程序的一个扩展。WoLF PSORT基于分选信号、氨基酸组成和功能motifs，例如DNA结合motifs，将蛋白质氨基酸序列转换为数值定位特征。转换之后，一个简单的k最近邻居分类器被用于预测。

甚至市场上也有一些相关产品，如Life Technologies推出了即用型的荧光蛋白载体，融合了信号肽，能将表达的荧光蛋白定位到亚细胞器中，如核、质膜、内质网、高尔基体和过氧化物酶体等等。这种CellLight®试剂将信号肽或细胞结构蛋白与emGFP和TagRFP融合，可准确且特异地定位到亚细胞区室和结构。

虽然蛋白定位亚细胞图谱能帮助科学家们获取前所未有的成像图片，但是蛋白只是构成细胞的几种主要元素之一，因此利用这些图谱并不能了解脂质和糖，不过对于目前的细胞研究来说，蛋白图谱依然是最先需要开始探索的一块土壤。

8、综合单细胞图谱

单细胞技术已经不再是什么新鲜事，几乎每年Nature Methods展望技术中都会出现它的身影，这主要是由于培养基或者机体中的细胞存在多样性，或者说是异质性，这为许多实验分析造成了障碍，因此随着现代生物学的发展，“平均值”这个词已经不能满足我们的需要了，我们要了解细胞之间的差异性。如果能综合各种单细胞图谱，那么就能帮助研究人员了解基因调控与基因异质作用机制。

在单细胞各种技术中，单细胞测序（single-cell sequencing）已经被越来越多的科学家当作一副新眼镜，重新审视他们的研究，在细胞水平上分析组织能令研究人员更了解异质性，也更能直接确定细胞的身份，比如新细胞类型（通过比较分子状态）。目前单细胞 DNA 和 RNA 测序方法正日趋成熟，还有一连串的表观遗传技术近期也达到了单细胞水平。也许未来我们就可以绘制同一细胞的多重图谱了。

单个细胞RNA测序技术已经日趋成熟，可以进行大规模分析，同样也能用作表型参照，推断细胞的功能，确定细胞身份。目前检测单细胞基因表达的方法包括DNA甲基化、染色质辅助功能、组蛋白修饰和染色体结构等方面。不过虽然这些成果显著，但大多数方法得益于更好的基因组覆盖率和更清晰的信号，还有待解决的方面包括高降噪技术、由于采样问题出现的数据稀疏，以及生物变量（如来自细胞周期的差异，批处理影响和生化随机性等)。

研究已经证明，从批量细胞表观遗传数据获取搜集机制或因果机制都很困难。许多数据类型存在相关性，细胞群体基因表达之间存在复杂的相互作用。如果能够了解同一个细胞的表观遗传特征和RNA特征，那么就能提供更加直观的解析，如表观遗传状态如何影响基因表达的机制解释，RNA如何反馈到表观遗传变化的机制解释等等。

此外，基因表达可以从理论上用作样品中亚群的细胞分类，将单细胞RNA数据与检测表观特征其它分析进行比对（一个实验中的DNA甲基化与另一个实验中DNA的可接近性），就能识别出每个亚群中表观特征之间的关联，以及它们对基因表达的潜在影响了。

综合单细胞技术对于干细胞生物学，发育与组织异质性研究都具有十分重要的意义，如果有足够的样品，那么这就应该可以解决表观遗传变化在特殊位点如何影响基因表达这个问题。