血凝抑制试验

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1  适用范围
本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。
本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。

2  血凝试验
2.1  材料与试剂
2.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。
2.2.2  pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，配制方法参见附录A。
2.2.3  1%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B。
2.2.4  阿氏液，配制方法参见附录C。
2.2.5  标准禽流感病毒抗原，购入的标准禽流感病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关实验室验证。

2.2  操作程序
A. 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25 μL PBS。
B. 吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混匀。
C. 从第1列孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细胞对照。
D. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20-25℃）静置45 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

2.3  结果判定
A. 在红细胞对照孔出现正确结果的情况下，将反应板作45°倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。
B. 最终结果取2倍、3倍倍比稀释抗原的血凝滴度的几何平均值。

3  血凝抑制试验
3.1  材料与试剂
3.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。
3.1.2  pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法参见附录A。
3.1.3  1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。
3.1.4  阿氏液，配制方法参见附录C。
3.1.5  4单位抗原，制备方法参见附录D。
3.1.6  HA效价高于10log2时可继续增加稀释的孔数。

3.2  操作程序
A. 根据血凝试验结果配制4单位抗原。以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：假设抗原的血凝滴度为1:256（28），则4单位抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4），稀释时，将1 mL抗原加入到63 mL PBS中即为4单位抗原。但是该4单位抗原必须经过验证（如附录D  4单位抗原的标定）后才可确定其稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定。
B. 取96孔V形微量反应板，用移液器在第1~11孔各加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。
C. 在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25 μL，设第11孔为病毒对照，第12孔为红细胞对照。
D. 在第1~11孔各加入25 μL 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温20-25℃下静置30 min。
E. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
F. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

3.3  结果判定
A. 在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，将反应板作45°倾斜，从反应板背侧观察。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。
B. 当被检血清对其HI效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。

附录A
pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na2HPO4）
磷酸二氢钾（KH2PO4）
加蒸馏水至
将上述成分依次溶解，用盐酸（HCl）调pH至7.2，分装，121℃、15 min高压灭菌，一经使用，于4℃保存不超过3周。

附录B
1%鸡红细胞悬液配制
采集至少3只2~6月龄SPF公鸡或无禽流感和禽流感抗体的非免疫鸡的抗凝血液与等量柠檬酸钠溶液混合，放入离心管中，加入3~4倍体积的PBS混匀，以1500 r/min离心5~10 min，去掉血浆和白细胞层，反复洗涤三次，最后吸取压积红细胞用PBS配制成体积分数为1%的悬液，于4℃保存备用。

附录C
阿氏液的配制
葡萄糖（C6H12O6．H2O)
柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O)
柠檬酸（C6H8O7.H2O）
氯化钠（NaCl)
加蒸馏水至100 ml，溶解，过滤，分装，121℃、30 min高压灭菌，4℃保存备用。

附录D
4单位抗原的制备
根据血凝试验测定的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数，并作复归试验。例如：病毒2倍倍比稀释时的HA效价为9log2，3倍时的HA效价为8log2，其4个血凝单位为6log2~7log2，则将病毒在96~128倍稀释。则可以假定90×，100×，110×，120×，130×为4HAU，分别再作2×、3×、4×、5×、6×稀释，每个4个孔，并作红细胞和病毒对照，依此做一次血凝实验，从而确定4单位抗原。判定时4×的半数100%凝集则为4单位抗原，1个100%凝集说明稀释倍数偏大，3个100%凝集稀释倍数偏小。