[转移贴]关于抗病毒药物在CHO细胞中的表达问题

viruskiller

原贴由nihaohuahua发表于 2011-7-20 16:54

战友们，大家好！小弟想做基因工程药物在CHO细胞中的大规模表达培养。有以下几个问题：
1.关于外源基因转入CHO细胞：我想问问载体的选择对于后面的表达量影响大么，不同的载体会造成表达量的巨大差异么？？（如果哪位战友做过这方面的工作并获得较大产量，那么你们用什么载体呢？）还有就是转染策略：是选择贴壁细胞转染、筛选成功之后再驯化成悬浮培养还是直接用CHO的悬浮细胞转染呢？另外，采用哪种方法转染效率高并且利用筛选到转入目标质粒的阳性细胞株呢？
2.有什么方法可以克服悬浮之后的细胞成团问题，也就是说能够实现细胞的高密度、不结团的大量表达么？？
3.有木有自制的无血清培养基？自制培养基需要考虑哪些加入物质？

viruskiller

Rojjer发表于 2011-8-25 11:53 ：

没做过这方面的工作，看过一些资料，提点个人想法：

1，表达载体的选择肯定会影响目的蛋白的表达量，这一点在抗体的大规模制备上显得尤为突出，可以说目前国内外抗体制备技术的差距除了体现在细胞培养技术上，还有一个重点就是细胞株与表达载体的选择和优化。是先转染还是先驯化，个人觉得从两反面考虑选择先转染，其一、悬浮细胞转染的难度比贴壁细胞难度大，其二，工作效率上，应该先获得稳定转染的细胞株后在进行细胞株的后续操作。转染方法，我们做其他实验时用脂质体-2000还行。

2，悬浮后聚集，据说肝素可以在一定程度上缓解；

3，无血清培养基的开发问题，还是得自己解决。国内在这方面也显不足，目前商业化的无血清培养基一方面价格比较贵，另一方面其实说是没有cell specific的，个人觉得没有哪一种无血清培养基能够满足所有细胞，等待工作做到一定程度后还需要去筛选与自己的细胞或者产品相适应的无血清培养基。这个应该是在前面各方面工作都坐上去以后再考虑的事情。当然，培养基开发也需要很长的路要走，也可以外包。
个人意见，仅供参考。

viruskiller

hxq78316 发表于 2011-8-26 16:15 ：

1.关于外源基因转入CHO细胞：不同的载体会造成表达量的差异么，所以在载体的选择上一定要注意。目前常用的真核表达载体可以根据文献有选择的使用。还有就是转染策略：悬浮细胞转染也可以实现，而且操作也不难。2.可以选择微纳米材料进行悬浮培养。
3.无血清培养基国外大公司技术比较成熟，自己要制备的话有些难度，主要是条件的摸索。  

viruskiller

nihaohuahua发表于 2011-8-31 11:40 ：

哦   谢谢各位战友的留言。  不过最近我看到丁香园有个帖子讲的策略是直接用驯化好的悬浮细胞进行转染，这样的话一方面可以直接筛选或者转染成功的细胞株，另一方面也确保了细胞的高度悬浮培养。因为将贴壁细胞驯化成为完全悬浮的细胞株是需要很长时间的，而且细胞生长情况会发生改变，如果是贴壁时转染之后再驯化估计会因为驯化时间长而导致转入基因表达量降低。