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实时荧光定量PCR的几个概念结果分析

发布者: ms003 | 发布时间: 2019-4-15 14:53| 查看数: 32| 评论数: 0|帖子模式

本帖最后由 ms003 于 2019-4-15 14:54 编辑

实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

  在对荧光定量PCR结果进行分析时首先要了解几个概念:

  基线(Baseline)指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。

  光域值threshold的设定,一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

  CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。



  融解曲线是用来验证扩增产物特异性的,如果产物是单一条带,融解曲线就会出现一尖峰;如果有引物二聚体或其它非特异性扩增,就会出现至少两个尖峰。

  Real-Time qPCR 常见问题分析

  1.无Ct值出现

  1)检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法

  则一般在退火结束时或延伸结束采集信号;

  2)引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性;

  3)模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;

  4)模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

  2.Ct 值出现过晚(Ct>38)

  1)扩增效率低:反应条件不够优化,设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等;

  2)PCR各种反应成分的降解或加样量不足,

  3)PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

  3.标准曲线线性关系不佳

  1)加样存在误差:使得标准品不呈梯度;

  2)标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品;

  3)引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针;

  4)模板中存在抑制物,或模板浓度过高。

  4.负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰

  1)引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现;

  2)引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比;

  3)镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒;

  4)模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

  5.扩增效率低

  1)反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解;

  2)反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法;

  3)反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板

  适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

  不知道小编分享的这些内容有没有帮助到大家,如果大家有比较关心的话题,欢迎与小编积极互动,大家一起学习、共同进步!

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