免疫印迹法在临床检验中的应用——过去、现在与未来

wwwkkk83

　（至今为止）许多关于免疫印迹法的探讨都围绕着其作为一种生物学研究工具的性能而展开，这并不足为奇。从上世纪70年代后期被引进以来，免疫印迹技术已经被几乎各类生物学实验室采用，成为科研中应用最广泛的技术之一。然而，免疫印迹法同时也被应用于临床实验室以辅助各种疾病的诊断，该方法在临床辅助诊断方面与在科研方面具有同等的重要性和价值，但目前关于其临床应用方面的讨论相对较少，而该技术的改进将对将来其临床运用的影响也少有提及。

　　Quest诊断公司医学免疫学主管Stanley Naides博士强调了免疫印迹法的临床价值，他指出：“免疫印迹法已经成为实验室和临床诊断的有力工具，它是实验室工作人员用来辅助临床医生进行疾病诊断、治疗方案选择和疗效监测的众多方法之一。”其实，免疫印迹法经常被用来辅助诊断丙型肝炎、艾滋病、莱姆病和梅毒等感染性疾病，同时也包括一些自身免疫性疾病，如：副肿瘤性疾病和肌炎等。

　　然而，Naides很快指出，需要根据方法学的灵敏度和性能来选择能够应用于临床的试验技术，而且人们从未停止去寻找更好的方法。“我们总是不断在寻找更优化的方法来检测靶蛋白，” Naides说，“许多时候我们舍弃免疫印迹法而选择其它更敏感的方法。”但也有时候我们还是回过头采用免疫印迹法来检测。“我们舍弃其它方法，是因为已经出现了一种灵敏度和特异性更高得免疫印迹法。随着新检测目标的出现，我们常常在不同的检测方法之间选择取舍（以达到最佳的检测性能）。”

　　近年来，对优化检测方法的探究使得临床实验室常脱离免疫印迹法而采用更敏感且特异的诊断试验，至少在对某些疾病的诊断上是这样的。以HCV感染的确诊为例，西门子医疗健康诊断部免疫组主管Sai Patibandla博士解释说，在HCV感染的确诊中不采用免疫印迹法是因为出现了一种改良的技术——重组免疫印迹试验（RIBA）。RIBA简化了传统免疫印迹法的步骤，将重组抗原固定在膜条上，用于筛查患者样本中的HCV抗体。该方法省去了分离蛋白及将蛋白转膜的步骤。

　　用RIBA检测HCV的方法是2006年从诺华疫苗与诊断公司获得、由Chiron公司首先制造生产的。该方法1999年获得FDA批准，并以“Chiron RIBA HCV 3.0膜条免疫印迹试验”推向市场。Patibandla表示，在当时Chiron公司的该试验是唯一拥有FDA认可的HCV确证试验。2013年，由于有报道称此RIBA试验在检测HCV时出现假阳性结果，该试验被停止使用并从市场撤回。

　　从那以后，临床实验室开始舍弃基于免疫印迹法的试验而选择敏感性更高的核酸检测法（NAT），用于HCV的确诊。“对于HCV诊断的确证试验，我们转而使用NAT，不再用免疫印迹法了。现在我们确诊HCV已经不需要借助免疫印迹法了。” Patibandla说。

　　HIV感染确证试验的建立也遵循相似的发展历程。事实上，2014年疾病防控中心发布的最新文件推荐NAT可部分取代免疫印迹法用于HIV的检测。此项改变回应了在HIV感染早期阶段HIV-1的免疫印迹试验会产生假阴性或中介结果的发现。

　　在这个当口，很难预测临床实验室对疾病的诊断逐步摆脱免疫印迹法的趋势是否会持续下去。但有一件事是肯定的，临床医生和检验人员都是实用主义者，他们渴望使用更具敏感性、特异性和有效性的方法来代替现有的技术。而这也提出了一个问题：当下正在为改进免疫印迹法的效能而做出的努力能否研发出一种新的检测试验，使其比现在采用的诸如NAT的技术更敏感。

　　美国加州大学伯克利分校生物工程学教授Amy Herr博士在该领域做出了一项令人振奋而具有开创性的工作。Herr的团队关注到了一些免疫印迹法最具挑战性的缺陷，并正在开发可能给该试验带来改革的新技术。比如，免疫印迹法最多只能做到半定量，这一弱点大大限制了多种情况下对蛋白含量变化的检测结果类型。

　　为了增加免疫印迹法的定量功能，除了其它方面以外，Herr的团队鉴定了试验过程中蛋白样本的质量损失。关于此现象，Herr解释说，传统的免疫印迹法采用的是个开放系统，包括实验材料、缓冲液和试剂等的许多处理步骤使蛋白的质量损失很难解释清楚原因。同样地，据Thermo Fisher Scientific高级产品经理Kevin Lowitz描述，“免疫印迹法是个简单但又费力的方法，在实验过程中有许多步骤和机会可能影响到实验结果。”

　　Herr的方法是要减少免疫印迹法的开放性。“我们正在开发更密闭的系统使我们能够解释每个实验阶段中蛋白质量的损失。我们并不对每个靶蛋白都这么做，但这样的密闭系统对蛋白质量损失方面确实提供了一个好的处理方法。”她说。Herr的实验室用于降低蛋白质量损失的主要机制之一是利用共价键而不是结合力更弱的疏水键将蛋白固定到印迹的基质上，从而保持蛋白质在膜上的适当位置（防止蛋白的丢失）。

　　另外，Herr的团队也在开发微流体平台，使免疫印迹法能在单细胞水平完成。“在我们的系统里，可以在四小时内同时进行几千个单细胞水平的独立免疫印迹试验，而且我们希望在未来几年中把检测时间缩短到一小时。”

　　其他为了显著提高免疫印迹法的灵敏度、定量能力和检测通量所做的改进仍然处于研发和探索中，目前取得的进展令人欣喜。例如，毛细管电泳的运用使得蛋白质通过一根充满电解质的细小管道，并在到达印迹膜条前按照大小和电荷进行分离，这种方法大大减少了免疫印迹法分析中蛋白质的用量，从而使免疫印迹法可以用于检测稀有细胞中的蛋白或那些样本量极其有限的蛋白。

　　美国加州大学、旧金山海伦迪勒家族综合性癌症中心助理医师Jillian Silva博士表示，检测技术的改进同时也扩展了免疫印迹法的检测能力。“随着荧光检测技术的出现，我们已经有办法用免疫印迹法进行定量检测，如今该方法的定量能力比以前更强了。” Silva说。

　　至于以上这些研究进展能否产出一种被临床实验室所采用的技术，我们拭目以待。正如Patibandla指出的，“强调免疫印迹法作为一种科研工具而非临床检验手段，会使针对该技术的改进偏向于优先考虑科研人员而不是临床医生的需求。免疫印迹法在科研领域具有一定的用途，研究者们总是在探究新生事物，尝试去拿到新的蛋白，所以免疫印迹法必不可少。”相比之下，她认为目前对于免疫印迹法的临床应用仍然是有限的。