中国学者Plos Pathogen发表抑制EV71病毒广谱中和抗体结构机制

rentianyixu

3月3日，国际学术期刊PLOS Pathogens 在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心（上海）丛尧课题组与中国科学院上海巴斯德研究所黄忠课题组的合作研究论文Structural Basis for Recognition of Human Enterovirus 71 by a Bivalent Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody。该研究采用高分辨率冷冻电镜技术结合生化分析揭示了抗肠道病毒71（EV71）单克隆抗体D5结合以及抑制病毒的结构基础，为基于D5抗体的抗EV71药物开发提供了新思路。

　　手足口病（hand-foot and mouth disease, HFMD）每年都在亚太地区的婴幼儿中广泛流行。在中国，每年有上百万儿童感染手足口病，严重影响儿童健康。手足口病主要由肠道病毒感染导致，EV71是最主要的致病原，也是导致重症手足口病的罪魁祸首。目前，EV71灭活疫苗刚被批准上市，尚无用于治疗EV71感染的特异性药物。黄忠课题组前期自主研发的抗EV71单抗D5拥有强大体外抗病毒活性，可用于进一步开发抗EV71药物，然而对于该抗体的作用机制及其结构基础的了解尚不足。冷冻电镜技术近几年发展迅速，已成为超大分子复合体高分辨率结构研究的重要手段，但针对病毒－抗体复合物体系，由于其动态性及组成的不均一性，分辨率水平普遍在10 Å左右，只有近期几个冷冻电镜结构达到6-8.8 Å。

　　丛尧与黄忠密切合作，带领博士后叶晓华和樊晨等实验室成员，依托国家蛋白质科学中心（上海）的先进冷冻电镜设施，解析了系列不同EV71病毒颗粒与D5抗体形成复合体的高分辨率冷冻电镜三维结构（最高达4.8 Å），成为首例分辨率突破5 Å的病毒－抗体复合体冷冻电镜结构。结构分析显示，D5抗体可以跨越病毒的两重对称轴，以双价的方式结合在成熟病毒颗粒上，该种双价结合方式很可能具有稳固病毒颗粒，阻碍病毒构象变化的作用，从而抑制后续的病毒基因组释放。进一步分析表明，D5抗体的结合表位为病毒VP1蛋白的GH loop，该表位在不同EV71亚型间极度保守，并且直接参与病毒与其脱衣壳受体SCARB2蛋白的相互作用。因此，抑制病毒与脱衣壳受体的相互作用是D5抗体的一个主要作用机制。同时，功能实验显示D5抗体不仅可以在体外中和多种不同基因型的EV71毒株，而且在体内完全保护小鼠免于致死剂量的EV71病毒感染。该项研究揭示了广谱保护性抗体D5结合EV71病毒并抑制其感染的结构基础，从而促进了基于D5的抗EV71单抗药物的开发。

　　该研究得到国家蛋白质科学中心（上海）冷冻电镜系统及数据库与计算分析系统的大力支持。参与该研究的还包括清华大学教授张林琦，及Purdue大学教授Wen Jiang。该研究得到国家自然科学基金委、国家科技部、中国科学院战略性先导科技专项（B类）和上海市科委等的资助。

　　（A-D）不同EV71病毒颗粒与D5抗体的完整IgG或Fab片段形成复合物的冷冻电镜结构；（E）4.8 Å的F-particle-Fab的VP1蛋白局部细节放大图；（F）F-particle-Fab密度图中D5抗体Fab片段与EV71相互作用区域放大图。

丛尧 研究员，研究组长，博士生导师 电话：20778199 E-mail: cong@@sibcb.ac.cn

个人简介：
　　1995年7月辽宁师范大学获学士学位；2000年7月吉林大学获博士学位。2000年9月至2001年10月，在中科院大连化学物理研究所从事博士后研究工作。2001年11月至2005年5月，先后在美国Scripps研究所及德州大学休斯顿健康信息中心的Willy Wriggers研究组任博士后。其中2004年1月至2005年12月获美国W. M. Keck 基金会Postdoctoral Fellowship资助。2005年6月至2011年7月，美国Baylor College of Medicine，先后任Research Associate, Instructor。2011年7月起，任中科院上海生科院生化与细胞所研究员、博士生导师。获中科院“百人计划”（2013年）和国家基金委“优秀青年”（2013年）基金资助。

研究方向：分子伴侣协助下蛋白质折叠与解聚的结构生物学

研究工作：
　　本研究组致力于解析分子伴侣协助下的蛋白质折叠与解聚的机理。主要实验手段包括超低温冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒重组以及低温电子断层扫描技术(cryo-Electron Tomography)，并结合生物信息学和分子柔性装配等计算工具。
        蛋白质折叠中的缺陷通常伴随着许多人类疾病，包括癌症及蛋白聚集引起的神经退行性疾病，如帕金森氏综合症和亨廷顿舞蹈病等。分子伴侣(chaperone)是一类可以协助细胞中蛋白质正确折叠的分子机器，其中真核细胞中双环背对背堆叠的多聚体分子伴侣素(chaperonin)TRiC/CCT是最为复杂的分子伴侣。它可以帮助~5-10%胞质蛋白的折叠，包括许多重要的结构和调节蛋白。然而，由于其结构的复杂性导致对此重要分子机器的结构知之甚少。我们的研究兴趣在于解析分子伴侣如TRiC是如何识别并结合它的底物，三磷酸腺苷(ATP)触发下其构象变化与底物蛋白正确折叠之间的相互关系。长期着眼，我们会进一步研究重要分子伴侣极其cochaperone之间如何相互作用来共同协助底物蛋白质的折叠与解聚。
        我们的另外一个研究方向是二维图像对位(image alignment)方法及分子柔性装配(flexible fitting)工具的发展及其在cryo－EM数据处理中的应用。我们发展了创新性的二维快速转动匹配方法，简称FRM2D。该方法不仅计算精度高于传统方法并且极大缩减了计算时间。此方法已成功应用于十余个中、高分辨率大分子复合物结构的三维重组过程中。此外，FRM2D方法已被嵌入冷冻电镜领域三大应用最广泛的单颗粒重组软件包之一EMAN之中，供其在世界范围内的用户免费使用。

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姓    名： 黄忠 学科类别： 疫苗学/免疫学   
学    位： 博士 职    称： 研究员
电    话： 021-54653077 传    真：  
职    务：  
电子邮件： huangzhong@sibs.ac.cn
通讯地址： 上海市重庆南路225号
教育背景： 1987.09-1991.07: 学士，中国农业大学。
1991.09-1997.07: 博士，中国农业大学。

工作经历： 2009.01- 至今　　中国科学院上海巴斯德研究所研究员，疫苗学与抗病毒策略研究组组长；
2005.09- 至今　　美国亚里桑那州立大学生物设计研究所传染病与疫苗学中心研究助理教授；
2002.09-2005.09: 美国亚里桑那州立大学生物设计研究所传染病与疫苗学中心高级研究助理（Faculty Research Associate）；
1998.02-2002.09:　美国康奈尔大学Boyce Thompson研究所博士后
研究方向： 疫苗学与抗病毒策略

获奖及荣誉： 中科院百人计划入选者(2010)

rentianyixu

PLoS Pathog. 2016 Mar 3;12(3):e1005454. doi: 10.1371/journal.ppat.1005454. eCollection 2016.
Structural Basis for Recognition of Human Enterovirus 71 by a Bivalent Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody.Ye X1, Fan C2, Ku Z1, Zuo T3, Kong L2,4, Zhang C1, Shi J1, Liu Q1, Chen T1, Zhang Y2,4, Jiang W5, Zhang L3, Huang Z1, Cong Y2,4.
Author information

• 1Vaccine Research Center, Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.
• 2National Center for Protein Science Shanghai, State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.
• 3Comprehensive AIDS Research Center, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing, China.
• 4Shanghai Science Research Center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.
• 5Markey Center for Structural Biology, Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana, United States of America.
  

Abstract

Enterovirus 71 (EV71) is the main pathogen responsible for hand, foot and mouth disease with severe neurological complications and even death in young children. We have recently identified a highly potent anti-EV71 neutralizing monoclonal antibody, termed D5. Here we investigated the structural basis for recognition of EV71 by the antibody D5. Four three-dimensional structures of EV71 particles in complex with IgG or Fab of D5 were reconstructed by cryo-electron microscopy (cryo-EM) single particle analysis all at subnanometer resolutions. The most critical EV71 mature virion-Fab structure was resolved to a resolution of 4.8 Å, which is rare in cryo-EM studies of virus-antibody complex so far. The structures reveal a bivalent binding pattern of D5 antibody across the icosahedral 2-fold axis on mature virion, suggesting that D5 binding may rigidify virions to prevent their conformational changes required for subsequent RNA release. Moreover, we also identified that the complementary determining region 3 (CDR3) of D5 heavy chain directly interacts with the extremely conserved VP1 GH-loop of EV71, which was validated by biochemical and virological assays. We further showed that D5 is indeed able to neutralize a variety of EV71 genotypes and strains. Moreover, D5 could potently confer protection in a mouse model of EV71 infection. Since the conserved VP1 GH-loop is involved in EV71 binding with its uncoating receptor, the scavenger receptor class B, member 2 (SCARB2), the broadly neutralizing ability of D5 might attribute to its inhibition of EV71 from binding SCARB2. Altogether, our results elucidate the structural basis for the binding and neutralization of EV71 by the broadly neutralizing antibody D5, thereby enhancing our understanding of antibody-based protection against EV71 infection.