慢性乙型肝炎疗效监测标志物的应用进展

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作者：李雪芬 陈瑜
单位：浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室，感染性疾病诊治协同创新中心

我国是乙型肝炎高发区，尤其是在慢性乙型肝炎基础上进展而成的肝硬化、重型肝炎、肝细胞肝癌等，严重影响人口健康和社会发展。近年来慢性乙肝抗病毒治疗虽然取得明显进展，但尚无有效的慢性乙型肝炎根治的有效药物和治疗手段，感染肝细胞乙肝病毒的清除和慢性乙肝的临床治愈仍不理想。现阶段，为了提升疗效，乙肝抗病毒治疗正在从单药治疗转变为多药联合治疗、续贯治疗，因此，能够早期、精确监测疗效的实验室标志物显得十分重要，作为治疗方案选择、优化的关键依据，以期达到持续的抗病毒效果和清除病毒。

一、HBV血清学标志物与疗效监测

HBV血清学标志物包括HBsAg和抗–HBs，HBeAg和抗–HBe，抗–HBc等。其中，HBeAg是最早用于抗病毒疗效监测的指标，HBeAg和抗–HBe的血清学转换仍是抗病毒治疗持续应答的重要证据。特别是近年来，血清HBeAg已能定量分析，监测HBeAg浓度变化可更早预测远期的血清学应答[1]。Fried等发现，在接受长效干扰素治疗48周的患者中，治疗12周时，HBeAg浓度低于10 PEIU/ml的患者中有53%在72周时出现血清学转换，而治疗12周时，HBeAg浓度高于100 PEIU/ml的患者中仅有14%在72周时出现血清学转换[1]。

近年来，由于HBsAg也实现了精确定量，因此，用于疗效监测获得一些新发现。血清HBsAg浓度较血清HBV DNA更能反映肝内HBV复制情况，血清HBsAg下降不仅表示病毒复制降低，还意味着肝内cccDNA量或cccDNA转录和mRNA翻译减少。研究发现，HBeAg阳性患者，经干扰素或核苷类药物治疗12～24周，血清HBsAg浓度仍高于20 000 IU/ml患者，则预示治疗无效；而HBeAg阴性者，其初始HBsAg浓度小于1 000 IU/ml，经治疗后可出现持续应答直至HBsAg转阴并产生抗–HBs[2,3]。Moucari等[4]研究发现，早期的血清HBsAg浓度下降，是预测长效干扰素抗病毒治疗持续应答(sustained virological response，SVR)的显著标志，治疗12周时HBsAg浓度下降5～10倍预测SVR的阴性预测值为90%，阳性预测值为89%。我们的研究也证实，慢性乙肝患者治疗初始HBsAg浓度越低，越容易获得血清学和病毒学应答，HBsAg浓度高低与抗病毒治疗疗效密切相关[5]。

新近研究显示，抗–HBc定量检测与抗病毒治疗血清学及病毒学应答具有独立的相关性。相比于初始抗–HBc滴度<30 000 IU/ml的HBeAg阳性患者，抗–HBc滴度≥30 000 IU/ml者具有更高的HBeAg血清学转换、HBV DNA转阴率及更持久的应答效果，今后抗–HBc也许是抗病毒疗效预测的新指标[6]。

二、HBV DNA、基因型、耐药突变与疗效监测

基于实时荧光定量PCR技术发展起来的HBV DNA定量检测是目前乙型肝炎抗病毒治疗疗效评价的常用指标。实际临床工作中常根据HBV DNA的应答变化调整治疗方案，如治疗12周后HBV DNA下降<1个log单位，可认为是原发无应答；治疗24周时HBV DNA水平是评估早期疗效预测因素；另外，治疗过程中HBV DNA持续降低并维持在低水平而又突然出现上升时，应警惕可能有HBV的耐药突变发生[7]。Shin等报道治疗前DNA<105 copies/ml者，抗病毒治疗后90%以上呈现有效的病毒学应答，而DNA>108 copies/ml者，只有5%出现有效应答，两者间具有显著的反向相关性[8]。对于HBV DNA ≥108的初治患者，联合用药(如恩替卡韦加替诺福韦)不仅比单剂治疗具有更高的血清学、病毒学应答，而且抑制HBV DNA的复制，肝内cccDNA水平也随之下降，肝脏病理检查显示，绝大部分(86%甚至高达96%)患者能减轻肝细胞炎症坏死，可明显改善肝脏纤维化程度甚至逆转纤维化，对控制病情进展和演变具有积极意义[9,10]。目前国内外荧光定量HBV DNA检测试剂，其定量范围在1×101～1×109 IU/ml之间，(1 IU/ml ≈ 5.6 copies/ml)[11]。因此，PCR检测HBV DNA阴性的完全应答者，应继续治疗方案，每6个月监测；而HBV DNA 60～<2 000 IU/ml的部分应答者，增加另一种没有交叉耐药的药物，或继续每3个月监测；对HBV DNA≥2 000 IU/ml的不充分应答者，增加另一种没有交叉耐药的药物，或换成另一种更强效的药物，并且每3个月监测[12]。

根据HBV全基因序列差异≥8%或S区基因序列差异≥4%，HBV分为A～J 10个基因型[13]。HBV基因型不仅与乙肝的严重程度有关，而且也用于抗病毒应疗效监测和预后判断[14]。相比较A和B型HBV，C型HBV的患者有更高水平的HBV DNA，经抗病毒治疗更难发生e抗原血清学转换，也更容易发生基因突变；研究同时也显示，A型HBV对抗病毒治疗最敏感疗效最显著，D型对抗病毒治疗的疗效最差；抗病毒治疗48周或更长时间，A型HBV的患者HBsAg下降最快，幅度最高；相比较而言，D型HBV患者下降最慢，幅度也最低[14]。因此，HBV基因型的检测对临床治疗方案及疗效判断同样具有重要意义。

HBV易发生变异，如前C区和基本核心启动子(BCP)的变异可产生HBeAg阴性变异株；P基因变异主要见于POL/RT基因片段(349～692 aa，即rt1～rt 344)；而S基因变异可导致隐匿性HBV感染(occult HBV infection)，表现为血清HBsAg阴性，但仍有HBV低水平复制。抗病毒治疗的长期性使得病毒耐药位点的检测成为临床治疗中必不可少的检查项目。不同的药物具有其常见的突变位点，如拉米夫定(LAM)等L–核苷(酸)类似物主要耐药变异常发生于DNA聚合酶c区YMDD结构域，该部位正是LAM抑制HBV复制的关键。YMDD中的n204位Met(M)可被Val(V)或Ile(I)取代，即由YMDD变异为YVDD(rtM204I)或YIDD(rtM204V)，导致该亚结构域的空间构型改变，从而妨碍了与LAM的结合[7,15]。阿德福韦(无环磷酸酯类)耐药变异位点主要集中于P基因D区nN236T位点和(或)B区rtAl81V/T，另外还有nP237H、nN238T/D、rtN236T、rtQ215S及rtV214A等。此外，新型的核苷类抗HBV药物替比夫定治疗可出现M204I/V和A181T/V耐药位点、恩替卡韦可检测耐药位点L180M、T184I/A/G/L、S202I/G和I169T的变异情况[7,15]。临床上通过耐药位点的检测，为联合用药、增加没有交叉耐药的药物配伍、完善抗病毒疗效的方案提供了实验依据。

三、HBV特异性T细胞与疗效监测

HBV是一种非细胞毒性病毒，其引起的慢性肝炎主要是机体免疫系统清除病毒感染的肝细胞而引起的免疫损伤。业已认为，机体细胞免疫应答的程度，特别是HBV特异性T细胞应答，直接影响感染的转归[16,17]，因此，HBV特异性T细胞用于抗病毒疗效监测已成为当下研究重点[18,19]。

已有的研究显示，慢性乙肝患者接受拉米夫定治疗期间，随着HBV DNA和HBeAg的下降，外周血特异性T细胞数量和杀伤靶细胞能力均较治疗前明显增多和增强，对特异性肽段(HBV core 18–27肽段)刺激反应明显增加，与且HBV DNA下降同步，两者具有明显的相关性[20,21]。近期的类似研究发现，经长效干扰素、恩替卡韦、阿德福韦、替比夫定等治疗后，HBV特异性T细胞的增殖和分泌细胞因子的能力增强[22,23,24]。同样，核苷类抗病毒药替比夫定疗效明显影响外周血T细胞变化，抗病毒治疗早期(12周时)完全应答效组伴随着血清病毒载量的快速下降，HBV特异性T细胞数量以及分泌IFN–γ能力显著高于部分应答组和无应答组[24]。监测治疗早期HBV特异性T细胞的变化，可预测远期抗病毒疗效，显示了其优于HBV血清学、病毒学指标而成为抗病毒疗效评价的新生代指标。

慢性HBV感染导致特异性T细胞数量减少、功能减弱，使T细胞处于耗竭状态(T cell exhaustion)，表现为细胞表面耗竭分子如程序性死亡受体1(programmed death–1，PD–1)，淋巴细胞活化基因–3(Lymphocyte–activation gene 3，LAG–3)，T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T–cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM–3)，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen–4，CTLA–4)和CD244(2B4)等的表达上调，分泌抗病毒细胞因子如IFN–γ的能力持续下降，不利于病毒的有效清除[25,26]。慢性乙肝患者经过抗病毒治疗后T细胞表面耗竭分子表达会发生明显变化，有效抗病毒治疗随着外周血中HBV–DNA拷贝数下降，T细胞表面抑制性分子PD–1、Tim–3的表达也明显下调，细胞分泌细胞因子IFN–γ的能力量明显增强，它们之间具有密切的相关性[27,28]。今后，监测这些新型的细胞免疫功能参数也许更能反映个体疗效差异及利于预后评估。

四、展望

抗病毒虽然是当前通用的慢性乙肝治疗方法，但病毒的彻底清除最终还是要依靠机体自身的免疫功能。近年来，随着对HBV特异性细胞免疫应答机制研究的不断深入，针对恢复HBV特异性CD8＋T细胞功能的单克隆抗体及重组细胞因子制剂等免疫疗法已逐渐应用到抗慢性HBV感染中，且获得了理想的临床效果[29,30,31]。同时，运用HBV特异性T细胞监测抗病毒疗效，建立HBV感染者治疗效果免疫评价体系，推行简单、有效的免疫学评价指标指导抗病毒治疗的临床应用不断涌现，有力促进疗效监测水平的提高。

总之，随着实验检测技术的发展和新检测方法、平台的建立，无论是经典的HBV血清学、病毒学标志物，还是热点追踪的细胞免疫学研究，终将对临床慢性乙型肝炎治疗方案及疗效监测的指导更加全面、深入。相信，随着对乙型肝炎免疫发病机制研究的深入，检测手段的不断改进和优化，终将为抗HBV感染的早期疗效监测及预后评估开辟新途径。

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