Science：张锋团队今日带来CRISPR重磅新应用，核酸检测灵敏...

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今日，知名华人科学家张锋教授与同事在《科学》杂志上发表论文，介绍了一种全新的CRISPR应用工具，用以检测核酸。这一工具能快速检测RNA或DNA分子，灵敏度甚至有望检测出单个核酸。这一重磅研究对于科研与全球公共卫生有着极大的影响。

早在2010年，科学家们就意识到，CRISPR平台也许能被用来检测病毒的核酸。但在当时，它的基因编辑潜力过于出众，光芒在一定程度上掩盖了其他领域应用的可能性。直到CRISPR-Cas9基因编辑技术趋于完善之时，科研人员才有余力检视它在病毒检测上的潜力。

科学家们在今日发表的这个系统与CRISPR-Cas9系统有着本质上的差异。它由向导RNA（gRNA）和Cas13a蛋白等部分组成。向导RNA能带领Cas13a蛋白识别并剪开带有特异序列的RNA。然而Cas13a有一个奇怪的特点，当它切开特异的RNA后，就无法管住自己的“双手”，开始疯狂切开它能遇到的任何RNA。利用这一特性，张锋教授与James Collins教授在这套系统里塞入了一种带有RNA的荧光标志物。平时它不会发出荧光，但一旦Cas13a到处“搞事情”，这种荧光标志物的RNA就会被切开，让它发出明亮的光芒。

▲这项全新CRISPR应用的原理（图片来源：《科学》）

也就是说，只要设计好合适的向导RNA，并提供Cas13a与荧光标志物，那么一旦这套系统识别到匹配的RNA序列，就会发出荧光，告诉研究人员“我们找到了！”

这套系统的灵敏度达到了50fM（1fM为10的负15次方摩尔每升）。

尽管和之前的一些研究相比，它的灵敏度提高了数百万倍，但研究人员依然没有满足。他们想要把灵敏度进一步提高，增加到阿摩尔级（aM，10的负18次方摩尔每升）。为了达到这一目标，他们又用上了“等温扩增”（isothermal amplification）技术，进一步降低了对初始核酸浓度的需求。

在后续的实验中，研究人员发现，使用“等温扩增”技术的这套CRISPR系统无论是对RNA还是DNA，灵敏度都达到了单分子级。

这种不遗漏任何线索的特性让研究人员想到了福尔摩斯（Sherlock Holmes）。于是他们杜撰了一个名字，把这套系统称为SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）。

这套系统开发出来可不是为了好玩。研究人员相信，它能用于各种疾病的检测。首先，研究人员在不同的病毒上测试了它的特异性。实验表明，它能很好地区分两种很类似的寨卡病毒株。这对于准确诊断病情，有效预防疫情爆发而言，有着现实的应用价值。

随后，研究人员又开始将它用于检测癌症突变。在癌症的早期诊断领域，液体活检是一大热门——科学家们希望从血液中分离出专属于癌细胞的突变，从而得知癌症是否开始发作。然而，由于血液中有着大量的非癌细胞DNA，这一检测过程也是困难无比。在今日发表的论文中，研究团队使用现成的样本，来模拟患者的血液。而实验表明，SHERLOCK同样能以阿摩尔级的灵敏度，识别出肿瘤特有的突变。

▲在人类基因组中，这套系统能轻松检测出不同的SNP（图片来源：《科学》）

类似的应用还有很多。比如，研究人员用这套系统，成功地鉴定出了人类基因组中的多个单核苷酸多态性（SNP），并能分析出每一个人的特定SNP是纯合还是杂合。在这个基因组的时代，SHERLOCK能得到很广泛的应用。

“能将Cas13a应用到灵敏度如此非同寻常的工具中，我感到非常激动。无论对科学还是临床医学，它都是很强大的工具。”张锋教授说。

▲Cas13a蛋白是这套系统的关键（图片来源：《科学》）

“我们现在能有效地制作针对任何核酸的探测器，在诊断或研究领域的应用上，这项工具无比强大，”该研究的另一名资深作者James Collins教授说道：“这项工具能在患者的血液中寻找到极少量的肿瘤DNA，帮助研究人员理解肿瘤的突变如何随着时间推移发生改变。另外在公共卫生领域，它也能帮助研究者监控耐药菌的发生频率。科学上它有无限让人激动的可能。”

Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2

Rapid, inexpensive, and sensitive nucleic acid detection may aid point-of-care pathogen detection, genotyping, and disease monitoring. The RNA-guided, RNA-targeting CRISPR effector Cas13a (previously known as C2c2) exhibits a “collateral effect” of promiscuous RNAse activity upon target recognition. We combine the collateral effect of Cas13a with isothermal amplification to establish a CRISPR-based diagnostic (CRISPR-Dx), providing rapid DNA or RNA detection with attomolar sensitivity and single-base mismatch specificity. We use this Cas13a-based molecular detection platform, termed SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), to detect specific strains of Zika and Dengue virus, distinguish pathogenic bacteria, genotype human DNA, and identify cell-free tumor DNA mutations. Furthermore, SHERLOCK reaction reagents can be lyophilized for cold-chain independence and long-term storage, and readily reconstituted on paper for field applications.