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生物通报道：第二代测序技术(NGS)因其快速和灵敏的检测特点已成为植物病毒学研究的强有力工具，这一技术具有非序列依赖性的优势, 能同时检测植物样品中可培养和不可培养的、含量高及含量低的所有的 DNA 病毒、RNA 病毒以及类病毒, 它的出现极大地变革和推进了病毒的发现历程，近期来自浙江大学生物技术研究所等处的研究人员围绕 NGS及其在植物病毒发掘中的应用研究和前景进行概述和展望。
植物病毒俗称植物上的癌症, 其流行和爆发严重威胁粮食生产和人类食品安全. 据不完全统计, 全世界每年因植物病毒病造成的农业损失占粮食作物总产量的 10%. 对植物病毒病进行快速准确地诊断对于病毒病的防控十分重要和紧迫. 病毒诊断一般要求达到检测并鉴定病毒到种的水平. 检测植物病毒的传统方法包括血清学检测、电子显微镜观察、指示植物接种、 通过 PCR 或 RT-PCR 进行的 DNA 扩增、芯片杂交等. 上述方法使用的一个重要前提是对病原物的基因组特性、 血清学特性、 生物学特性、理化特性等有预先的了解, 而在对未知病原物了解缺乏的情况下, 这些检测方法就显得耗时长、效率低下、容易出现检测误差等问题, 因此极大地限制了其在实际工作中的推广和应用。
近年来，第二代测序技术(next gene- ration sequencing, NGS)发展迅猛，与 Sanger 测序技术相比, NGS 是一种能一次对几十万到几百万的DNA 分子进行序列测定的高通量的测序技术, 这种高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌地分析成为可能, 因此又被称为深度测序(deep sequencing). 相比传统的个体基因组测序, NGS 使得测序价格日益廉价, 并且在生物信息学软件的辅助下, 可以将大量不同基因片段的信息连接起来进行基因组组装, 完成生物的基因组测序，这种新的测序技术革新了植物病毒的诊断方法, 对于病毒的流行病学和生态学研究起到了非常重要的推动作用。
就此研究人员围绕 NGS 及其在植物病毒发掘中的应用进展进行概述，文章首先介绍了NGS技术平台的建立与发展，重点聚焦于Roche公司的 454测序技术 ， Illumina 公司的 Solexa 技术，以及 ABI 公司的 SOLiD技术，并对这些技术进行了比较，见下图：
文章还介绍了基于宏基因组学的 NGS，宏基因组学(metagenomics)是一种以特定生态环境中微生物的群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段的新研究方法[27], 已被广泛地应用于海洋生物、植物、人类疾病等的候选病毒资源发掘和病毒多样性的研究。
2007 年, Cox-Foster 等人首次报道利用基于 NGS 的宏基因组学对病毒进行诊断. 他们从来自美国的患有群体崩溃紊乱症(colony collapse disorder, CCD)的蜂群、 来自美国和澳大利亚的健康蜂群和中国进口的蜂王浆中提取总RNA后构建cDNA文库, 利用454 GS-FLX平台进行 NGS, 对组装的 contigs 在 NCBI 数据库进行比对, 结果在感染 CCD 的蜂群中发现了 7 种病毒以及一些来自细菌、真菌等的病原, 尽管未发现新的病毒, 但最终确认以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)是 CCD 发生的指示病毒。
此外还有基于小RNA深度测序的 NGS，目前利用 NGS 测定 siRNA 已在一系列植物的未知病原鉴定中发挥了重要作用. 一个典型的案例来自 Li 等人对美国和墨西哥分离的表现斑驳、花叶、矮化、叶畸形等症状的 4 个番茄样品的小RNA 进行 NGS. 他们通过消减寄主来源的 siRNA 对vsiRNA 进行富集和组装, 进一步的生物信息学分析显示, 形成的 contigs 能拼接出一个完整的马铃薯纺锤形块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)的基因组序列, 并证实 2 个核苷酸同源性为 82%的PepMV 株系(Eu 和 US1)在美国样品中普遍存在复合侵染现象. 进一步通过在 NCBI 数据库进行的BLASTx 比对, 发现来自墨西哥样品的 2 个最长的contigs 与几个已知的马铃薯病毒科病毒的氨基酸序列同源性在 60%左右, 利用这 2个 contigs有 13 nt重复的特点, 通过重叠RT-PCR和RACE扩增的方法获得了一个长 10057 nt 的新的马铃薯病毒科病毒。
最后文章还介绍了NGS的优势和局限性。
相比其他的植物病毒检测方法, NGS 具有独特的优势, 主要表现在: (ⅰ) NGS 是一种快速检测病毒的手段. 传统方法对于未知病原的检测周期非常长, 绵延数月甚至数年, 而 NGS 一般一个测序反应需要2~3 天即可完成, 后期的数据分析和病毒的确认一般也可在短时间内完成, 因此, NGS 能够快速诊断生产实践上的疑难杂症和一些爆发性病害的病原, 这将为病害防治提供依据; (ⅱ) NGS是一种广谱的检测病毒的手段. 无论是 DNA 病毒、 RNA 病毒还是类病毒, 都能在一个测序反应中被检测到, 不受病毒基因组类型的限制; (ⅲ) NGS 检测病毒灵敏度更高. 因为NGS 测定的不是病毒序列, 而是在 RNA 沉默这个寄主防卫反应过程中抵抗病毒侵染产生的高度冗余的小 RNA 或病毒的转录本, 所以即使极低效价的病毒也能被鉴定出来; (ⅳ) NGS能够对多个不同来源的样品同时进行病毒检测[47]. 由于每个植物样品的cDNA都带有特异的标签, 因此序列来源可以追溯到原始的寄主, 这样可以在不同地理带的同种植物间、同一地理带的不同植物间快速比较病毒的分布和变异进化等特征; (ⅴ) NGS能够通过非序列同源性的方式发现病毒. 传统方法对于那些和已知的病毒序列完全缺乏同源性的新序列在认定上存在困难, 目前已经通过NGS测定siRNA和新的逐渐过滤重叠siRNA的数据分析方法, 在葡萄等植物上发现了和已知的类病毒序列完全缺乏同源性的新类病毒。
而弊端和不足主要表现在: (ⅰ) 除了一些病毒滴度非常高的病毒, NGS往往很难得到一个病毒的完整基因组序列. 一方面, 在利用软件对测序的高通量数据进行拼接的过程中往往会产生一些 gap, 这些 gap 需要借助常规的 PCR 方法来补平; 另一方面, 包括病毒5′和3′端在内的一些序列往往是缺失的, 需要借助已获得的病毒序列设计特异性引物来进行RACE扩增和常规的Sanger测序; (ⅱ) NGS尽管能获得很多病毒的序列, 但是该方法很少能直接证实获得的序列和病毒病之间的相关性, 而且在对新病毒分类时因为缺少传毒介体、寄主范围、病毒粒子等信息而显得困难重重; (ⅲ) NGS会产生相当多的序列信息, 结果依赖严谨的软件算法和生物信息学分析, 针对不同的样品选择合适的分析方法是大多数实验室面临的一个挑战。
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钱亚娟, 徐毅, 周琦, 等. 利用深度测序技术发掘植物病毒资源. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 351–363
Qian Y J, Xu Y, Zhou Q, et al. Application of next-generation sequencing technology for plant virus identification. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44: 351–363, doi: 10.1360/052014-54
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发表于 2015-4-30 09:03:55
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