微滴式数字PCR在HBV cccDNA检测中的应用

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微滴式数字PCR由于其绝对定量的特点在病毒的核酸检测中也有很好的应用前景，尤其是对于低拷贝或极低拷贝的病毒进行核酸检测。从目前的文献发表情况来看，欧美科学家主要将ddPCR技术应用于HIV相关的核酸检测，而作为一个乙肝高发国家，中国科学家则努力尝试将ddPCR应用于HBV相关的核酸检测。下面这篇文章由重庆医科大学第二附属医院肝病研究所廖勇实验室完成，主要探讨ddPCR在cccDNA检测中的结果及临床应用的可行性。



HBVcccDNA研究的重要性

HBV共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)是HBV复制的初始模板。在HBV感染的肝细胞细胞核内持续、稳定地存在，被认为是HBV感染慢性化及抗HBV治疗停止后复发的最主要原因。cccDNA是嗜肝DNA病毒在肝内进行复制的原始模板，虽然其含量较少，但对病毒在宿主细胞内感染状态的建立以及维持病毒在细胞内的复制过程具有十分重要的意义。与rcDNA不同，cccDNA位于宿主肝细胞的细胞核而非细胞浆中。

嗜肝DNA的病毒基因组是一种松弛环状的双链DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)分子，其两条链均不闭合，其中负链较长。在病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋cccDNA分子，在电镜下证实为大小约3.2kb的超螺旋DNA分子。

当前慢性乙型肝炎抗病毒治疗难以彻底清除病毒，皆因cccDNA不能被彻底清除。只有清除肝细胞核内HBVcccDNA，才有实现治愈慢性乙型肝炎的目的。近年来，随着以实时荧光定量PCR技术为代表的各类cccDNA检测技术日渐成熟，以及临床医生对cccDNA检测临床意义的认识不断提高，cccDNA检测已从基础研究逐渐进入到临床应用。

HBVcccDNA检测的难点

1．大量与cccDNA序列同源性较高的其他形式的HBVDNA。包括：成熟病毒颗粒中的松弛、环状、双链DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)分子；部分病毒颗粒中存在的双链线性DNA分子(double-strandlinearDNA，dsDNA；由前基因组RNA(pregenomicRNA，pgRNA)逆转录形成的单链DNA(single-strandedDNA，ssDNA)；

2．含量少，仅存在于肝细胞的细胞核内，约为30~50copies/cell。在接受抗病毒治疗的情况下含量更低；

3．检测样品有限，目前最可靠的cccDNA检测标本是肝脏组织。

文章目的：采用基于绝对定量的ddPCR对HBVcccDNA进行检测，验证该技术将来在临床应用的可行性。

测试对象：ATCC的HepG2.215细胞系和pcDNA3.1-HBV1.3质粒。经过核酸纯化后，前者建立梯度如下：200，100，50，10，and1ng/ul；后者梯度稀释如下：10-5~100pg/ul(anequivalentof100~105copies/ul)。

测试方法与平台：Bio-RadQX100dropletdigitalPCRSystem和Bio-RadCFX96TouchReal-timePCRsystem。2组不同的TaqManAssay设计思路，一种是专门针对cccDNA序列设计；一种是针对HBVDNA保守区域设计。前者只能特定检测cccDNA；后者能检测所有的HBV序列。

测试的不同条件

1．PSAD(Plasmid-safeATP-dependentdeoxynuclease，能降解除去非环状结构的HBVDNA)处理与不处理情况下的ddPCR结果；

2．cccDNA特异性assay与HBV通用型assay。

结果分析之ddPCR的灵敏度：以10-5~100pg/ul的pcDNA3.1-HBV1.3质粒为对象，ddPCR的检测灵敏度可达单拷贝。且在上述浓度范围内，实际检测得到的拷贝数与理论值一致。



结果分析之PSAD处理对结果的影响：PSAD处理能有效去除其他非环状结构的HBVDNA分子，显着降低ddPCR检测得到的绝对拷贝数。



结果分析之cccDNA特异性assay与HBV通用型assay的ddPCR结果：cccDNA的ddPCR检测含量说明，cccDNA特异性assay较之HBV通用型assay能更针对于cccDNA的检测，并且经过PSAD处理后能进一步提高检测的特异性。



结果分析之ddPCR与QPCR结果比较：以cccDNA特异性assay对200，100，50，10，and1ng/ul梯度稀释的HepG2.215细胞系DNA进行分析，QPCR实现有效检出的最低含量为50ng的HepG2.215细胞系DNA，而ddPCR仅为1ng。



上述不同测试条件下经过计算得到的拷贝数见下表汇总。可见基于ddPCR的核酸检测能够对HBVcccDNA实现灵敏并精确的定量，有望在临床上实现对慢性肝炎病人的组织样品进行检测及抗病毒的疗效评估。（生物谷Bioon.com）

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