乙型肝炎病毒表型耐药检测技术的研究进展

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　福建医科大学第一临床医学院吴淞航和福建医科大学附属第一医院检验科欧启水在中华检验医学杂志2015年03月第38卷第03期发表题为“乙型肝炎病毒表型耐药检测技术的研究进展”文章，现将其内容详情转载以供读者分享，以下为内容详情：

　　作为主要的抗ＨＢＶ 药物，核苷（酸） 类似物［ｎｕｃｌｅｏｓ（ｔ）ｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＮＡｓ］已被临床广泛应用。然而长期使用ＮＡｓ 容易诱发ＨＢＶ 逆转录酶（ｒｅｖｅｒｓｅｔａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＲＴ）区基因突变并导致耐药，严重影响抗病毒治疗的效果［１－２］ 。目前耐药监测主要是检测耐药相关突变位点，属于基因型耐药（ｇｅｎｏｔｙｐｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）检测。然而，这种方法存在灵敏度低、无法检测未知耐药位点等局限性。此外，由于ＨＢＶ 病毒群往往以“准种”的形式存在，仅发现耐药位点，特别是突变型基因在病毒群中比例较低时，尚无法确定其是否发生临床耐药［３］ 。为了弥补上述缺陷，必须借助表型耐药检测技术。

　　所谓表型耐药，是指在体外细胞培养系统中证实ＨＢＶ 基因组中一个或多个位点突变，使病毒对药物的敏感性降低或丧失，是耐药诊断的确切依据［４］ 。表型耐药的检测结果一般以半数有效浓度（ＥＣ５０ ）或半数抑制浓度（ＩＣ５０ ）表示，其与ＨＢＶ 野生株耐药检测结果的倍数值可直接反映耐药程度的高低。与传统分析方法相比，表型耐药检测技术不仅可以探知未知突变的耐药性，还可模拟体内ＨＢＶ 耐药的自然过程，因此在ＨＢＶ 耐药的动态监测及早期诊断方面都具有重要价值［５］ 。近十多年已相继研发出瞬时转染细胞模型（ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、稳定转染细胞模型（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）、酶活性分析（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ）等多种技术用于检测表型耐药，且方法日益成熟。

一、依赖瞬时转染细胞模型的表型耐药检测

　　构建ＨＢＶ 感染的体外细胞模型一直是表型耐药检测的经典途径，依靠细胞培养，可以准确地模拟ＮＡｓ 的体内代谢过程。瞬时转染是构建细胞模型的常见手段，凭借瞬时转染，目的基因将伴随重组ＤＮＡ 进入细胞中，实现短暂又高水平的表达，从而有助于快速、高效地完成表型耐药检测。

１．无载体参与的细胞模型（ｖｅｃｔｏｒ－ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ）：在不使用载体的情况下，将完整的ＨＢＶ 基因组转染至真核细胞中即为无载体参与的细胞模型。Ｇüｎｔｈｅｒ 等［６］ 使用一种针对ＨＢＶ 基因组负链缺口区的引物，实现一步法扩增ＨＢＶ 基因全长。病毒基因组进入细胞之后，线性ＤＮＡ 即可发生环化作用，进而在细胞内启动ＨＢＶ ＤＮＡ 的复制和转录。该研究由于建立了较为高效的全基因扩增方法，故有别于传统的定点诱变（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）技术，可以很好地模拟ＨＢＶ 自然感染背景［７］ 。尽管如此，依赖线性ＤＮＡ 的自身环化可能导致细胞内的ＨＢＶ ＤＮＡ 复制效率低下，而后来的载体转染途径，因为克服了上述难题，已被更加广泛地应用于表型耐药的研究领域之中［５］ 。

２．质粒载体参与的细胞模型（ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｄｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ）：质粒载体参与的细胞模型首先构建含有ＨＢＶ 全基因组的重组质粒载体，转染至真核细胞后即可在不同药物浓度背景下，从细胞上清液中检出ＨＢＶ 表达产物，进而计算ＩＣ５０ 或ＥＣ５０ 。这种模型有几个基本的特点：（１）所使用的载体携带外源性启动子，经重组后的ＨＢＶ 基因组在细胞内可以形成高度的表达活性；（２）由于ＨＢＶ 基因组的开放读码框（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ， ＯＲＦ）相互重叠，插入载体的ＨＢＶ 基因组必须达到完整基因组１．１ 倍以上长度，才能在体外表达；（３）鉴于ＨＢＶ 基因组具有高度异质性，通常不使用ＨＢＶ 基因组的内源性酶切位点进行克隆操作。

　　传统的载体转染细胞模型常预构建含ＨＢＶ 全基因组的重组载体，通过定点诱变技术在ＨＢＶ ＲＴ区产生与耐药相关的点突变，如Ｚｈｏｎｇ 等［８］ 利用定点诱变技术，将一种少见ＲＴ 区突变ｒｔＮ２３８Ｈ 引入含ＨＢＶ 全基因组的重组质粒，并证实了ｒｔＮ２３８Ｈ 突变株对拉米夫定（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ， ＬＭＶ）以及阿德福韦酯（ａｄｅｆｏｖｉｒ ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ， ＡＤＶ）皆具有较好的敏感性。虽然定点诱变技术在构建新型耐药突变株方面具有快速、简单的优点，但是只诱导单一的点突变往往忽视了一个完整病毒基因组所具有的生物学特点，也无法用于病毒临床分离株的耐药检测，因此具有较大的局限性［５，７］ 。而使用严格设计的表达载体，可以与患者体内获得的ＨＢＶ 基因组直接连接，既保留了自然背景下ＨＢＶ 基因组的完整性，还获得了高效的体外复制性，目前已逐渐代替定点诱变技术成为表型耐药检测的通用策略。

　　早前有学者报道了一种新型质粒载体ｐＨＹ１０６，该载体含有与ＨＢＶ 全基因扩增技术相匹配的限制性内切酶位点，同时在酶切位点两端预存了０．１ 倍长度的ＨＢＶ 基因片段［５，９］ 。在此基础上，只需再插入１．０ 倍长度的ＨＢＶ 全基因组即可以完成重组载体的构建，大大降低了克隆的难度，为表型耐药检测的临床应用打下基础。利用这种载体，目前已成功完成特定临床病例，如多药耐药及ＨＢＶ 合并ＨＩＶ 感染病例的药物敏感性分析［１０－１１］ 。几乎在同时，Ｄｕｒａｎｔｅｌ 等［５］ 也报道了一种新型质粒载体ｐＴｒｉＥｘ－Ｍｏｄ。与其他方法不同的是，该载体没有预存任何ＨＢＶ 基因组片段，因此所插入的ＨＢＶ 基因组必须利用分步ＰＣＲ 来扩增至１．１ 倍基因组长度。据报道，这种分析策略亦已成功实施于ｒｔＡ１８１Ｃ、ｒｔＬ２２９Ｆ／Ｗ／Ｍ／Ｖ、ｒｔＭ２０４Ｑ 等少见突变病例的表型耐药检测中，为临床合理用药提供了第一手资料［１２－１４］ 。

　　近年来，表型耐药检测技术又有了新的方法。人们对传统克隆步骤进行了改良，比如利用片段置换反应（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＦＳＲ）技术来构建１．１ 倍ＨＢＶ 基因组重组体，可以直接取代传统的酶切连接，将ＰＣＲ 片段替换到质粒载体上，大大简化了原本较为繁杂的分析过程［１５］ 。另一方面，新的进展还体现在载体改造与分析策略之上。Ｚｈｕ等［１６］ 所报道的ＲＴ 区克隆策略，可以仅通过置换重组载体ＲＴ 区，来对ＨＢＶ 临床分离株进行表型耐药分析，从而避开了复杂困难的全基因克隆方案，实现了更加快速简便的重组载体构建。Ｑｉｎ 等［１７］ 则建立了一种新的酶切策略，能在表型分析阶段，将获取的ＨＢＶ ＤＮＡ 复制中间体进行了Ｘｈｏ Ｉ 酶切，致使不同的病毒株ＤＮＡ 在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交后形成特异性条带而被良好区分。这种新的策略使得在共转染的条件下，同时对两种不同的病毒株进行表型耐药检测成为可能，因此在ＨＢＶ 准种群的研究方面十分具有价值。

３．杆状病毒载体参与的细胞模型（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ）： 杆状病毒载体参与的细胞模型最早于１９９９ 年为Ｄｅｌａｎｅｙ 等［１８］ 所报道，其具有体外复制水平高，可调控表达等优点，这使之在随后数年广泛应用于ＨＢＶ 的耐药研究。近几年，更多高效的杆状病毒载体被报道，这些载体往往是含有强哺乳动物启动子（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）的高效载体，能只依靠较有限的培养细胞便准确验证突变株对相应抗病毒药物的耐药性［１９－２０］ 。甚至还有学者将这类载体成功地应用于猕猴肝细胞模型中，更证实了动物模型应用于ＨＢＶ 耐药研究的可行性［２１］ 。除此之外，杆状病毒载体还被用于ＨＢＶ ＲＴ 区和Ｓ区联合突变位点的研究，如Ｌｉ 等［２２］ 通过定点诱变技术分别将７ 种ＡＤＶ 相关的ＲＴ 区突变引入杆状病毒重组载体中，发现ｒｔＡ１８１Ｔ 位点的突变常合并ｓＷ１７２Ｓｔｏｐ 突变， 含这一类突变株的细胞模型ＨＢｓＡｇ 分泌水平均明显减低。总而言之，杆状病毒载体与质粒载体相似，亦是表型耐药检测的经典方法之一。

二、依赖稳定转染细胞模型的表型耐药检测

　　与每次检测过程都要进行载体转染的瞬时转染细胞模型相比，稳定转染细胞模型具有可重复操作的优点。这类细胞模型的构建，主要依靠表达载体所携带的抗性基因，此基因一经转染即可与宿主细胞基因组融合，被转染细胞继而获得抗性，经多次抗性筛选便形成稳定表达细胞系。最早应用于耐药检测方面的稳定转染细胞模型由Ｌａｄｎｅｒ 等［２３］ 于１９９８年创建，近年来常用的细胞系有ＨｅｐＡＤ７９ 细胞系、ＨｅｐＧ ２．２．１５［２４－２５］ 等。

　　稳定表达细胞系一经建立便能成为特定病毒株基因表达的固定场所，其可变性较低，特别适用于ＨＢＶ 耐药机制及抗病毒药物筛选等研究领域。例如，Ｚｈｕ 等［２６］ 通过ＡＤ３８ 稳定表达细胞系研究了替诺福韦酯（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ， ＴＤＦ）的药理学特点。体外试验发现，ＴＤＦ 与任何一种抗病毒药物联合使用时，都可以产生不同程度的协同作用，这客观上证实了ＴＤＦ 作为联合用药方案的合理性。Ｂｉｌｌｉｏｕｄ等［２７］ 则成功构建了含９ 种不同类型突变株的稳定表达细胞系，并将各细胞系所产生的病毒颗粒包被在丁型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄ ｖｉｒｕｓ， ＨＤＶ）表面，以探讨不同类型的耐药突变均对Ｓ 区包膜蛋白（ｅｎｖｅｌｏｐｐｒｏｔｅｉｎ）的感染性的干扰作用，其结果进一步明确了ＨＢＶ ＲＴ 区耐药突变与病毒适应性（ｆｉｔｎｅｓｓ）及感染力（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）之间存在的潜在联系。

三、表型耐药检测的应用

　　表型耐药检测技术的应用领域广泛。在耐药机制研究等基础性领域，如ＨＢＶ 的适应性、感染性，ＲＴ 区耐药突变与Ｓ 区突变的相互作用机制等方面，表型耐药检测技术均发挥着重要的作用［２８］ 。而近年来多种质粒载体的推广，还使这项技术解决了过于依赖定点诱变等人为改造手段的局限性，真正服务于临床耐药的分析之中［５，９］ 。这包括：通过ＥＣ５０或ＩＣ５０ ，耐药检测结果可以定量的形式，直观地反映抗病毒药物的敏感性。在此基础上，结合不同时间点的检测结果，即能实现耐药的动态性监测，协助临床在耐药形成的早期调整治疗方案［１０］ ；另一方面，体外细胞模型的建立，使得精确模拟体内病毒群成为可能。比如可变性较好的瞬时转染细胞模型，可以针对各种不同病毒准种构成、不同临床表现及不同用药方案的临床样本，建立体外细胞模型，为慢性乙型肝炎的个体化诊疗提供了实验室依据［１１］ ；而可以重复操作的稳定转染细胞模型，则提供了标准化的实验模型，十分适用于新型抗病毒药物的临床试验［２９］。

　　如何将表型耐药检测技术应用于临床检验，关键是能否在体外准确重建患者体内的ＨＢＶ 准种群。近期一系列针对临床病例的检测结果已表明，使用载体介导的细胞模型，可以很好地模拟出体内ＨＢＶ准种群［１１，３０］ 。该细胞模型，通过大量收集单克隆来还原血清中的ＨＢＶ 准种构成，转染后细胞上清液中ＨＢＶ ＤＮＡ 与患者血清中ＨＢＶ ＤＮＡ 的序列无统计学差异，在此基础上进行的体外药物敏感试验便可以反映患者实际的耐药状态。因此，将表型耐药检测技术用于临床病例的耐药分析十分具有可行性。当然，目前表型耐药检测技术仍然存在一些局限性，制约其在临床的推广，比如分析周期较长、载体尚未商业化生产等。因此，如何进一步优化表型耐药检测技术，使其更加适用于临床耐药的分析之中，将会是这项技术今后研究的主要方向。

四、展望

　　ＨＢＶ 的耐药一直是困扰临床的一大难题，若能有效地对ＨＢＶ 耐药进行监测甚至是预测，对于避免临床耐药的发生意义重大。近年来，表型耐药检测技术快速发展，较好地弥补了传统检测手段的缺点，为临床耐药提供精确的诊断依据。该技术凭借体外细胞模型的建立，在进一步阐明耐药机制、实现动态性耐药监测、新型耐药突变的确定，乃至新型抗病毒药物的筛选等方面都具有广阔的前景。目前，表型耐药检测技术的研究侧重点已经从方法学探讨逐渐转移到临床耐药分析方面，走向临床已成为这项技术的发展趋势。总之，表型耐药检测技术对于促进临床合理用药、降低耐药发生率和实现个体化诊疗将具有重要的意义。