[转移贴]病毒灭活剂在抗病毒治疗中应用的可行性探讨

cao1976

原帖由论坛会员qrb发表于 2008-9-7 14:35

我们利用靶向制剂减毒增效的特点，将病毒灭活剂制成靶向剂型，用于抗病毒治疗。设计思路是：利用脂质体的细胞靶向性，灭活剂通过靶向转运到达病灶，灭活剂与病毒接触、灭活病毒。
以病毒的包膜为靶点，我们选择乙醚为灭活剂，以脂质体为靶向载体，制备乙醚脂质体。在初步的安全性试验后，将其用于对鸡尾酒疗法过敏的艾滋病患者，结果患者症状显著改善。我们实验小组的3人自己当的安全性受试者，病人只有两例（虽知此举于法不合，但当时病人已没有其他选择，有一丝希望就要试试。也是为了助人，结果还算幸运）。
对体内的效果分析，发现可能存在这样的过程：灭活剂通过靶向转运到达淋巴细胞—灭活病毒—诱导免疫作用—通过免疫机制再次杀灭病毒。
    以上推论是否有漏洞，仅两例病例是否能判断治疗有效，或者都是假阳性结果。用流感病毒小鼠模型验证，是否能作为参考，是不是必须做细胞试验才能算有效结果，才能证明作用机制？

cao1976

Rojjer发表于 2008-9-8 09:04

非常钦佩楼主科学精神，不过确实有点冒险哦！
看思路感觉是个不错的主意，有条件可以进一步探索研究。
我有几个小问题：
1，该药物可能不是一种广谱抗病毒药物：首先，就你选择的靶点来说只能是有包膜的病毒（当然楼主可以选择其他靶点），其次，我们知道大多数病毒的包膜是病毒在出芽时从感染细胞获得，在感染细胞内一般还没有形成病毒包膜，流感，HIV都是这种情况。（当然不排除少数病毒包膜由核膜或浆膜获得，胞内即产生有包膜的完整病毒，但是毕竟还是比较少)。所以个人认为其抗病毒谱有限。
2，脂质体的细胞靶向性问题：每种病毒一般情况下都会有其细胞或者组织嗜性，这就需要我们对脂质体进行修饰，让其具有和病毒一样的“细胞嗜性”，这样才能做到脂质体靶向于病毒感染的细胞。
3，体外病毒灭活剂种类很多，但是我怀疑将他们用于体内的可行性，比如乙醚来说，我想它至少对细胞内的膜结构（线立体膜会有很大损伤作用），当然其他的我就更不太清楚。
4，“灭活剂通过靶向转运到达淋巴细胞—灭活病毒—诱导免疫作用—通过免疫机制再次杀灭病毒”，集疫苗生产，接种，诱导免疫与一体，赋予了人体强大的抗病毒潜力，确实是个很好的想法。因为我们所用的灭活疫苗，在灭活以后都进行了一些其他工艺措施，对疫苗成分都进行了很多优化。我想楼主的“灭活疫苗”可能会引起比较大的副反应。在人体内病毒灭活的后继工作，楼主是否需要考虑考虑，增加适当的优化程序，当然难度比较大了，呵呵。

以上只是个人对楼主的设计的一些想法，望楼主参考，也希望更多的朋友参与的讨论中，旁征博引 集思广益，帮助楼主实现其远大科学理想，也算是为人类防病治病提供点支持吧，

cao1976

zhanggji发表于 2008-9-8 09:55

理想的病毒灭活剂至少满足两点：对病毒有杀灭作用，同时对人体无害。文中提到的乙醚脂质体的安全性可能存在隐患，乙醚是一种医用麻醉剂，可以作用在人体的中枢神经系统(CNS)，设想一下，如果楼主的乙醚脂质体通过静脉系统给药，那么进入人体的乙醚可能产生CNS相关的副作用，即使通过其它途径(消化道或肿瘤局部)给药，也会有很大的可能引起类似的副作用。再有，脂溶性质的乙醚和脂质体制剂结合能够形成有效的脂质体吗？
另外说一句，非常钦佩楼主的想法。我无意打消楼主的原创激情，只要有想法，加上各种可能性的否定，那么剩下的就是成功了。不成功上帝都不干！
祝您成功！

cao1976

qrb发表于 2008-9-8 22:09：

这个思路最初是借鉴了靶向抗肿瘤，靶向治疗利什曼病的原理。抗肿瘤药物的毒性一般都较大，靶向制剂能减少使用剂量，提高疗效；治疗利什曼病的砷、锑更是剧毒，制成肝靶向的脂质体后才有效的用于治疗。病毒灭活剂也是因为对人体损伤太大才无法用于体内，便设想若也将其制成靶向制剂，使其进入体内后集中于病灶，应该也能起到减毒增效的效果。
    选择乙醚也是出于安全性的考虑，毕竟作为曾经的麻醉剂，乙醚在临床应用过多年，直到现在还用于小动物实验的麻醉，我们对它的体内作用及毒性了解的相对更多一些，对不良反应也更容易处理。我们认为相比其他灭活剂，乙醚的安全性更高一些。而且做人用麻醉剂使用时一次手术一般都要用几十毫升，我们的治疗用量每天仅几毫升，即使有损伤，也是在可忍受的范围内的。考虑到艾滋病的特殊情况，病人的收益是大于损伤的。
    制剂的制备我们是按照脂质体注入法的工艺做的，其稳定性的确不太好，两周就会出现沉淀现象，尚未找到更好的解决办法。

cao1976

rojjer发表于 2008-9-12 11:06：

建议楼主多查查相关文献，设计出一个比较科学的实验，当然首先是在细胞水平了。
针对一些实验现象，作下理论分析，再找出相关优化措施！
祝您早日成功！

cao1976

qrb发表于 2008-9-12 16:01

我们想证明这样一个假设：把灭活疫苗的制备过程由体外转移到了体内进行。我们无法设计出用细胞实验表达整个过程。而且脂质体的转运机制已有很多研究报道，比较清楚了。乙醚灭活HIV是教科书上的知识，应该也是细胞实验的结果。脂质体的转运及灭活阶段我们就直接拿书本的知识来解释了，至于是否有免疫过程，则完全是根据结果而推导的假设。
    灭活疫苗的效力小于减毒活疫苗，而且课本说病人自己痊愈后的免疫效果最强。我想会不会是免疫系统的记忆学习功能在前种情况下得不到充分的发挥，就如同演习和实战的比较一样。如果把灭活疫苗的制备过程由体外转移到了体内进行，就会授之以渔而不仅是鱼，可能会诱导更强的免疫作用。这个解释大多数人都觉得在搞笑，老师也认为是做白日梦。已有的结果，都认为是偶然。我曾以为动物体内结果和疗效是最有力的，但现在大家都关注的却是细胞实验的结果，认为细胞和分子生物学才可信，不知该如何设计试验验证此过程是否存在。
    有什么好办法，给指点指点！多谢了。

cao1976

wittgen发表于 2008-10-17 15:06

乙醚为灭活剂，以脂质体为靶向载体，制备乙醚脂质体；两例对鸡尾酒疗法过敏的艾滋病患者--患者症状显著改善；实验小组的3人做安全性受试者--通过初步的安全性试验。

最后总结出：靶向灭活剂--转运到达淋巴细胞—灭活HIV病毒—诱导免疫作用—通过免疫机制再次杀灭病毒 的假说。

qbr的实验方案看起来简洁而又有效啊，把中间的细胞实验、动物实验的临床前评价都省去了，呵呵，做事风格也比较雷厉。潜在的理论风险rojjer兄分析了很多，我感兴趣的是你私下的临床试验怎么评价？有哪些观察指标？

如果实验结果真的反应了安全和有效的话，楼主还是好好设计下临床前的安全有效性验证，先为申请临床批文做好准备吧。

呵呵，楼主的“但现在大家都关注的却是细胞实验的结果，认为细胞和分子生物学才可信，不知该如何设计试验验证此过程是否存在。”言论，个人也比较的赞同尤其是学校里的研究

cao1976

一只蜗牛发表于 2008-10-19 15:38

“病毒的包膜为靶点”
我觉得这个可能会有问题。那意味着你的实验或者治疗可能只能针对体内正在活跃的进行病毒复制的个体，但对持留感染恐怕作用不大，因此对某些病毒，比如HIV不会达到根治的目的。
而你实验中两个病例有显著好转，可能是由于你的靶向性，局部提高了灭活剂的浓度，而且更专一，使得病情得以控制。但可能就只能达到控制的目的。
对于你的原创精神，赞一个！祝成功。

cao1976

cnbio6621发表于 2008-11-19 14:19：

疫苗灭活剂β-丙内酯（Beta-Propiolactone，BPL）
灭活是指破坏病原体的生物学特性，但尽可能避免影响其免疫原性或破坏血清中补体活性的过程。常用的灭活剂有甲醛、β-丙内酯(BPL)或其他有效灭活剂。
甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基（如A,G,U），又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活；用甲醛灭活时间长，一般需要在37-39℃处理24h以上或更长时间。并且灭活的效果易受温度、pH、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，在研究中应引起注意；残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生制激性反应。
而β-丙内酯(BPL)在国外已广泛用于各种疫苗的灭活。它是一种杂环类化合物(C3H4O2)，沸点155℃，常温下是无色粘稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用。
作用机理：作用于病原体DNA或RNA，改变病毒核酸结构达到灭活目的，而不直接作用于蛋白。
1.        特点：直接作用于病毒核酸，保持免疫原性，强灭活效果。β-丙内酯(BPL)直接与病毒核酸作用，而不作用于壳蛋白，不破坏病原体的免疫原性。
2.        极易水解，无残留，并且水解产物无毒无害。大剂量β-丙内酯(BPL)虽是一种致癌物，但极易水解，在37℃水浴水解2h后消失［1, 2］，其水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸［3］ 。另外，由于其能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留。
3.        灭活时间短，缩短了疫苗的生产周期。37℃仅需2小时β-丙内酯即可完全水解，灭活时间短，从而显著地缩短了疫苗生产周期，提高了经济效益。
总之，β-丙内酯(BPL)作为疫苗灭活剂,可直接作用于核酸，对病毒的灭活能力很强；不破坏病毒的血凝素抗原, 保持病毒良好的免疫原性；其水解产物对机体无害，接种反应轻。故早在1984年就被选作狂犬灭活疫苗的灭活剂正式使用，现已被广泛应用于各种疫苗。
订货信息（现货）
货号        产品名称        描述        规格
168-21011        Beta-Propiolactone        β-丙内酯(β-PL，BPL) 　5ml
166-21012        Beta-Propiolactone        β-丙内酯(β-PL，BPL)        25ml
        
分析指标
TEST                      SPECIFICATION
Appearance                  Colorless-nearly colorless,clear liquid
Density (20 deg. C)          1.146 - 1.153g/ml
Refractive index n20/D   1.410 - 1.415
Water                      (measured value)
Assay (capillary GC)          min. 95.0%
储存条件：           远离火源，密封，-20°C，避光，通风，干燥

参考文献：
1. Singh H.Laboratory techniques in rabies(Fourth edition)WHO Geneva,1996,234～2 40.
2. Montagnon B,et al.Laboratory techniques in rabies(Fourth edition)WHO Geneva,19 96,285～289
3. M.O.Schmita-Masse,Analyse de La β-propiolactone Par chromatogphie gaz- liquide I.REcherche d'un reside de β-propiolactone dans le Vaccin antirabique PasteurⅡ.Etude de la courbe d'hydrolyse de La β-propiolactone ápH7.4,Journa l of Chromatoyraphy,70(1972):128～134.

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