转移贴-请教：关于流感病毒感染MDCK 问题（药物筛选）

rojjer

原帖由xuqz005 发表于31/5/2010 20:35
大家好，我是做基于细胞的抗流感病毒药物筛选研究的。我通常是将细胞传至96孔板中，次日感染后加药培养。在我多次的实验中发现，在感染细胞后，发现同一药物孔间差异很大，病变程度不一致，通过
检测上清中NA活力也验证了这一结果，我一般是设有三个复孔。请大家给点建议，感染剂量是10 tcid50，感染1h

rojjer

cloud 回复：
我的一点经验：
1.细胞消化的问题：消化时间的掌握，我们一般T75的培养瓶，先把培养液吸干净，防止残留血清中和胰酶作用，然后用5ml胰酶洗一遍，中和残留血清，去掉一些死细胞，再加5ml胰酶放37度孵箱消化8-10min，消化时间的掌握要看细胞状态，是否长满，胰酶等因素，最好是镜下观察间隙变大细胞基本分开，但还贴壁，轻拍瓶子细胞流下最好。然后补10ml生长液，吹打10次左右，然后1500rpm/5min离心。弃去上清，轻摇或轻弹瓶底，使细胞打散，补10ml生长液吹打几下混匀后，细胞计数。
2.我们铺板的细胞数是3*10E4个细胞，下午或晚上铺板，待第二天早上长满70
%-80%(细胞处于对数生长期很重要）后，用PBS（常温）洗两遍后加稀释好的病毒悬液吸附40min-60min后用PBS洗一遍，注意换枪头或者从高稀释度到低稀释度吸出PBS
3.另外细胞代次一定不能太高我们一般都是20代以下
4.我记得这种抗病毒药物的研究好像用MOI定量的多一些，TCID50一般是用于做动物实验时病毒的定量

个人经验而已，希望对你的实验有帮助

rojjer

xuqz005 回复：
谢谢，不知道你们感染后空间的病变是否一致，你们是怎么检测病毒复制水平的？

rojjer

Johntl 回复：
我也是做抗流感药物的筛选的 大家爱可以交流一下 我QQ441675058  

rojjer

yuanjian0415 回复：
我想请问下：抗病毒药物筛选的实验室主要方法有那些？可以给我名称就好，更希望具体分享下。谢谢  

rojjer

荷塘 回复：
我觉得与细胞接种是否均匀，细胞的密度，以及病毒的感染量有很大的关系，你可以再调整一下方案