急求sf9细胞裂解液

cao1976

原贴volcano发表于 2009-11-11 16:19
http://biosky.haotui.com/thread-12695-1-2.html

大家好，
我是利用Bac-to-Bac系统表达蛋白，载体用的是pFstbacHTB，现在处在表达阶段，打算用Ni-NTA纯化蛋白。根据protocal 上建议的配置裂解液，貌似效果不是很好。
不知各位能不能给个建议，有什么好的裂解液，如果能给个纯化的整套ptotocal那就更好了。非常感谢！

cao1976

atfsu15 发表于 2009-11-12 20:05 ：我没弄过SF9，不过从裂解液上看也许可以商榷。

不论是50mM或者是100mM磷酸钠缓冲液，保证弱碱性pH的配方是，摩尔比Na2HPO4 : NaH2PO4 = 19：1，一般各自配成0.2M的储备液，用之前混合再调pH。反过来，保证弱酸性就要二氢钠多很多。

可以适当减少NaCl浓度，生理浓度是150mM。

可以尝试去掉咪唑，这个浓度是防止非特异结合的，但似乎NTA用不着。

你用的NP40是终浓度1%吗？感觉有点高了，但如果裂解细胞必须要这么多的话，建议可以先加1体积含1%NP40的裂解液裂解完成，再加9体积不含去污剂的缓冲液，甚至可以稀释更多一点，但其它盐浓度不要改。

在冰上孵育不是个好办法，为何不尝试超声破碎或者涡旋呢？不怕麻烦也可以用注射器小针头吹打。可以在裂解液中加不含EDTA的蛋白酶抑制剂。

你的方案最后会释放大量核酸，导致整个液体很粘稠，可以尝试加点Benzonase，在有蛋白酶抑制剂的前提下室温振荡15-20min，或者超声波裂解细胞。

可以延长柱结合时间，比如4度过夜。

当然最重要是你确定要的蛋白表达得不错，并且有结合柱子的那一段。

希望有点帮助，祝好运。

olezi

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