人胚肺二倍体细胞的制备与培养

病毒云

人胚肺二倍体细胞是生产甲肝疫苗、水痘疫苗、风疹减毒活疫苗、脊髓灰质炎疫苗、成纤维细胞干扰素等产品的常用细胞。主要来源于肺间质，其中大多数细胞都是成纤维细胞。
【材料】
1．组织来源自然流产或水囊引产的妊娠14～18周胎儿的肺组织。
2．培养用试剂
（1）清洗液：Hanks液，含有100U/ml青霉素与100 ug/ml链霉素。
(2）消化液：0.25％胰蛋白酶，pH7.2～7.4。
3．培养基配方和制备DMEM培养液，含10％～20％胎牛血清、100U/ml青霉素与100 ug/ml链霉素。
4．实验器材眼科剪、解剖刀、镊子、平皿、100目筛网、恒温电磁搅拌器和培养瓶等。
【方法】
1．取材 用75％乙醇消毒胎儿胸部，剖胸取出两肺，剔除支气管等组织，将肺边缘组织放入无菌平皿中，用清洗液充分洗净血液。选择苍白色的肺组织，剪成大小约1～2mm3的组织块，用清洗液洗2～3次，洗净血细胞，静置一段时间后弃上清液。
2．消化 将剪碎的肺组织块移入装有磁力棒的三角瓶中，加入5～6倍体积的0.25%胰蛋白酶，置37℃恒温电磁搅拌器上消化，即为热消化；或将装有0.25％胰酶和组织块的三角瓶置于4℃冰箱内消化过夜，次日取出，弃胰酶，即为冷消化。
3．分离细胞 向三角瓶中再加入适量的培养液，用吸管吹散细胞。静置片刻，以沉淀未消化完全的组织块。吸出细胞悬液后，用100目筛网过滤。
4．接种与培养 进行细胞计数后，调整细胞浓度为3x106个／ml，接种于细胞培养瓶常规培养。24小时后更换培养液，以后每隔2～3天更换培养液1次。
【结果】
人胚肺细胞接种后次日，进行原代细胞观察可见较多散在的贴壁细胞。一般情况下，在培养3～7天后可长成单层细胞。镜下观察，第一、第二代细胞常呈不规则三角形或梭形，混杂有少量上皮样细胞，而继续培养后细胞主要由成纤维细胞构成。肺成纤维细胞呈不规则梭形，细胞中央有卵圆形核，生长时呈放射状或旋涡状走行。
【注意事项】
1．每天观察细胞形态，如培养细胞折光性好、形态饱满、生长致密时即可传代。
2．所有操作要注意无菌操作。每次最好只进行一种细胞的操作，培养用液应严格分开，每一种细胞使用一套器材，防止细胞间的交叉污染。
3．如发现细胞有污染迹象，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的培养液反复清洗，随后培养液中加入较大量的抗生素，并及时更换培养液等。