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人胚肺二倍体细胞的制备与培养

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发表于 2017-3-5 09:03:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
人胚肺二倍体细胞是生产甲肝疫苗、水痘疫苗、风疹减毒活疫苗、脊髓灰质炎疫苗、成纤维细胞干扰素等产品的常用细胞。主要来源于肺间质,其中大多数细胞都是成纤维细胞。
【材料】
1.组织来源自然流产或水囊引产的妊娠14~18周胎儿的肺组织。
2.培养用试剂
(1)清洗液:Hanks液,含有100U/ml青霉素与100 ug/ml链霉素。
(2)消化液:0.25%胰蛋白酶,pH7.2~7.4。
3.培养基配方和制备DMEM培养液,含10%~20%胎牛血清、100U/ml青霉素与100 ug/ml链霉素。
4.实验器材眼科剪、解剖刀、镊子、平皿、100目筛网、恒温电磁搅拌器和培养瓶等。
【方法】
1.取材 用75%乙醇消毒胎儿胸部,剖胸取出两肺,剔除支气管等组织,将肺边缘组织放入无菌平皿中,用清洗液充分洗净血液。选择苍白色的肺组织,剪成大小约1~2mm3的组织块,用清洗液洗2~3次,洗净血细胞,静置一段时间后弃上清液。
2.消化 将剪碎的肺组织块移入装有磁力棒的三角瓶中,加入5~6倍体积的0.25%胰蛋白酶,置37℃恒温电磁搅拌器上消化,即为热消化;或将装有0.25%胰酶和组织块的三角瓶置于4℃冰箱内消化过夜,次日取出,弃胰酶,即为冷消化。
3.分离细胞 向三角瓶中再加入适量的培养液,用吸管吹散细胞。静置片刻,以沉淀未消化完全的组织块。吸出细胞悬液后,用100目筛网过滤。
4.接种与培养 进行细胞计数后,调整细胞浓度为3x106个/ml,接种于细胞培养瓶常规培养。24小时后更换培养液,以后每隔2~3天更换培养液1次。
【结果】
人胚肺细胞接种后次日,进行原代细胞观察可见较多散在的贴壁细胞。一般情况下,在培养3~7天后可长成单层细胞。镜下观察,第一、第二代细胞常呈不规则三角形或梭形,混杂有少量上皮样细胞,而继续培养后细胞主要由成纤维细胞构成。肺成纤维细胞呈不规则梭形,细胞中央有卵圆形核,生长时呈放射状或旋涡状走行。
【注意事项】
1.每天观察细胞形态,如培养细胞折光性好、形态饱满、生长致密时即可传代。
2.所有操作要注意无菌操作。每次最好只进行一种细胞的操作,培养用液应严格分开,每一种细胞使用一套器材,防止细胞间的交叉污染。
3.如发现细胞有污染迹象,一般应弃置污染的细胞,如果必须挽救,可加含有抗生素的培养液反复清洗,随后培养液中加入较大量的抗生素,并及时更换培养液等。
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