昆虫细胞破碎缓冲液

cao1976

原贴由JASON198205发表于 2009-9-20 10:02
http://biosky.haotui.com/thread-11849-1-4.html

各位战友好，菜鸟的我想问一下，我用重组的杆状病毒表达我的目的蛋白，细胞收获后，用的破碎缓冲液配方是如何配制的呀？
是用PBS加蛋白酶抑制剂吗？加入的酶抑制剂的浓度如何？对于昆虫细胞而言，哪种酶抑制剂效果较好呢？
多谢各位指点，先谢谢啦！

以下以会员回复：
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gpj402发表于 2009-9-21 14:31 ：以我个人经验，目的蛋白的纯化不用考虑如何配制，要考虑你的纯化条件，逆思维去推得所需要的破碎缓冲液的配方，PH值了，盐浓度等等。当然做这些之前你还要考虑你的目的蛋白的活性条件，对环境的耐受条件。这些都是纯化那里的知识。
蛋白酶抑制剂要看你用不用了，目前一般大家都是不用的，破碎完之后尽快纯化，之所以这样，是因为蛋白酶的各类很多，抑制的效果通常也不是太好，不仅如此，加入抑制剂后，还可能会影响你的最终产物。
如果你非要用蛋白酶抑制剂的话，也行，具体的浓度你参考说明书就可以了。具体的数值我也记不得。

去多想想吧，你自己不都说“Never give up”,呵呵。
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Elisabeth2009 发表于 2009-9-21 21:03 ：版主说的不错~ 如果是胞内表达的话，纯化才是问题所在，当然裂解液也可以透析之后替换为上样buffer。通常我们是上清表达，偶尔胞内表达的话，用的是RIPA中比较温和的那种lysis buffer(NP40), Pierce也有卖专门的昆虫细胞裂解液（比较贵就是了）， I-PER Insect Cell Protein Extraction Reagent。PI的话一般我们也不怎么加的， 偶尔会用sigma或者罗氏的蛋白酶抑制剂。