293细胞培养经验总结贴

cao1976

293细胞培养特性：
1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
4、复苏　293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。
5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。
其它的经验：
1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取
2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，
3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
5、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。
我个人的经验是：
1：换液时，液体要背着细胞的培养面加入。洗时动作要轻柔。
2：消化液，我的配方是0.125%的胰酶+0.01%EDTA, 另外我也用过0.02%EDTA.效果很好.
3: 多一言,养293时, 培养基的PH值最好是7.2以下,也就说相对酸,好一点.
一般而言，293细胞状态好的时候，贴壁还是比较牢的，如果你的细胞易于悬浮说明你的细胞状态不是很好。
293传代需要消化，我一般采用0.25%胰酶+0.02%EDTA,主要293细胞之间易于黏附，如果你要细胞状态好的话需要使用胰酶和EDTA。

293细胞的消化也是293细胞培养的重点和难点。293不消化直接吹打也是可以悬浮的，但是这样传代的细胞会抱团，分散不均匀，多次传代后细胞状态不好。建议用胰酶和EDTA的方法消化。

293好像对PH比较敏感，酸性环境下的细胞状态明显不好，出现大片脱落的话细胞状态肯定是不好了，也不用可惜了。
消化的时候可以用D－Hanks‘或者PBS洗一下，然后用胰酶浸润细胞，在细胞表面来回几次后直接弃去胰酶，在显微镜下观察细胞变圆后即可拍动瓶/皿，待细胞自行脱落，如果细胞还成大片，可以继续消化一会儿，等到细胞成小碎片后再中止消化。
培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3配置高糖的DMEM培养基1000ml，
1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解
2.加入NaHCO3 2.0g
3.加入谷氨酰胺 0.146g（终浓度为5mM）
4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml）
5.定容900ml
6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中
7.加入灭活小牛血清100ml。

DMEMF11培养液――取15．6 g DMEMF11溶于700～800 mL超声水中，加入3．7 g NaHCO3，用1 mol／L HCI或1 tool／L NaOH调节pH值至7．0～7．2，加超声水定容至1 000 mL，0．22 p,m滤膜过滤，根据需要加入5％ ～10％胎牛血清。
柠檬酸盐细胞消化液――50 g KCI、22 g柠檬酸钠加超纯水至500 mL即为10×柠檬酸盐细胞消化液，高压蒸气消毒(1．034×lo5 Pa)15 min后4℃冰箱贮存。临用前以无菌超纯水稀释l0倍即为1×柠檬酸盐细胞消化液。
低代次293细胞培养基的配制DMEMF11 90 mL加FBS 10 mL，再加入青霉素和链霉素终浓度为100 U／mL。即为10％FBS的293细胞培养基。
细胞的复苏 快速取出冻存的低代次293细胞，将其安剖的底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。在超净工作台中，以70％ 乙醇对细胞安剖表面消毒，将细胞转移至75 cm 的细胞培养瓶中，加入10 mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。6～8 h后待细胞贴壁更换培养基。这与传统的方法——离心洗涤后再转人培养箱内培养不同。
细胞的传代 待细胞的融合度至90％ ，以1：2的比率传代。首先吸出培养基，然后加入1×柠檬酸盐细胞消化液3～5 mL洗2遍，留取0．5 mL 37℃消化5～10 min。将培养瓶在桌面轻轻敲打使细胞脱壁、漂浮、分散，为使细胞进一步分散可轻轻吹打几次。然后加入培养基3 mL，温和混匀，分别取1．5 mL细胞悬浮液加入2个25 cm 培养瓶中，再加入2 mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内继续培养。
细胞的冻存 待细胞融合度至90％左右，吸出培养基以1×柠檬酸盐细胞消化液消化分散细胞，方法同细胞传代。加入5 mL培养基中和消化液，200×g离心5 rain收集细胞沉淀，再以1 mL细胞冻存液(90％FBS+10％DMSO)重悬，一70℃或液氮中冻存。

文献报道，该细胞在培养过程中不容易贴壁，生长活力低，易造成损伤，而且随着传代次数的增加包装病毒的生物学特性会丢失。在培养过程中为减轻细胞损伤，可：
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10 mL培养基中和细胞消化液，培养6～8 h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；
(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。细胞形态观察、贴壁率和生长曲线表明，这种方法对细胞损伤小，能维持细胞较好的生长状态。
NG等研究表明，低代次293细胞在培养过程中传代时融合度过高或过低，其整合的腺病毒El区基因易丢失；另外，不适当的传代比率也会导致细胞生物学特性发生改变。为此，笔者把细胞传代的融合度控制在90％左右，传代比率l：o以腺病毒感染质粒pFG140感染传l0代以后的低代次293细胞，可成功包装出腺病毒，表明这种传代方法可较好保持细胞的生物学特性。
本人也做过一段时间的293细胞培养，当时是用来扩增腺病毒的。看了楼主的描述，我觉得不贴壁与你3小时后的扰动关系不大。我倒是觉得你种细胞的浓度太 大。为什么要将15瓶的细胞收集起来再分别种于8个培养皿呢？浓度太大了。要知道293长到一定程度（>80％）的时候细胞的特性会发生变化。我一 般是将一瓶细胞悬浮，分别种于于2-3个培养皿中，然后让其生长到80-90％满，加入病毒原液。等到所有细胞变圆飘起就说明扩增过程完成了。这样培养 293在转染前的状态是最好的，对病毒扩增最有利！不像你的方法，一下种那么密，就算都能贴壁，那时的细胞密度已经接近80-90％，况且细胞都是才传代 的，状态肯定没有稀释培养法好。另外，给你个重要的提示：293细胞很容易吹打下来。不需要使用胰酶，反复吹打即可。长到80％的细胞更容易吹下来！胰酶 对293细胞的伤害很大，即使你的消化时间很短。希望对你有用。

cao1976

《293细胞的培养》：

By cyp2003
我觉得293细胞很好养，未发现脱落现象，培养基是高糖DMEM +10%胎牛血清（Gibco），80%融合时传代，一般1瓶传3瓶，次日细胞贴壁，如果脱落，多半考虑是污染（细菌或别人包装的病毒）所致。

By 华一
我也在养293细胞，我感觉不是很难养的，第一批细胞可能是冻存的时候出了问题，没有成功，第二批细胞一下就好了。我用的只是国产（成都）的小牛血清，浓度为10％，DMEM培养基里也没有另外加谷氨酰氨，只是在复苏时要耐心，刚复苏的293贴壁很慢的，我的经验是加双倍的DMEM培养基，这样DMSO就被稀释了，不必一定在24小时后换液（如果复苏细胞时没有离心的话），我是等了48小时，293才大量贴壁，然后换液，成活率较高。
当细胞只有30％－40％满瓶时（常规是80％－90%）,我发现细胞很多成团生长，分布不均匀，于是提前传代，在传代过程中，很重要的一点是胰酶消化不能过度，我加入胰酶后，只在孵箱中放置了1分钟，期间不断观察，现在细胞长的还不错。
通过比较，我也觉得，293在塑料培养瓶中比在玻璃培养瓶中长的要好些。
总之，我认为，试验最重要的，是要理解其原理，在规范操作的前提下，可以灵活运用。
至于为什么大瓶子要好些，我觉得可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取，个人之见

By Huangsiluo
没有比293更好养的细胞了，介绍以下我的程序:
培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3
培养瓶；Coring
传代：倒去废液，PBS洗二次，胰蛋白酶（小瓶1ML，大瓶2ML）处理5分钟，需拍打一下。加PBS5-10ML，离心1000转3MIN，加2ML培养基重悬，取0。3毫升到小瓶，0。5毫升到大瓶。瓶子可以不丢，重复使用，就是把酶解后的瓶子用PBS洗两次。我已经重复使用2个月了。

cao1976

by ms003

我去年的这个时候养过293细胞，是用来包装腺病毒的，刚开始养的时候听说这个细胞很难养，后来发现其实不然，说一下我的经验。
1. 刚开始培养我们都用胰酶消化，后来发现传代时根本不用胰酶，去掉旧培养液，加入新培养液吹打下来即可，不过这个细胞很娇贵，动作尽量轻柔。不过传代次数太多性状可能会发生改变，贴壁会较牢，反正我用了一年多，一直没用过胰酶。
2. 293不耐酸也不耐碱，但是在我养的细胞中并不是最不耐碱的，在传代时液体稍碱点问题不是很大，一般都会贴壁的。
3. 一般用10%FBS的高糖DMEM培养1：2传代时，3天左右就可以再次传代。
4. 我发现293的代数对细胞性状影响很大，一般连续传代10次后形态就改变很多，标准的293应该是多边形的，时间长了就呈类似纤维状的了，状态会越来越差，长的速度也会减慢。293细胞一般都是用来包装腺病毒的，细胞内的包装元件很重要，但是细胞代数太多里面的包装元件很容易丢失。我们一开始用本实验室保存的已经传了n代的293做转染时转染效率一直很低，包装病毒后感染靶细胞一直没荧光，也就是没包装成功，后来换了从法国带来的代数较低形状很典型的293细胞，一次就成功了。
这只是我的个人经验和意见，仅供参考，希望能给正在做的朋友一点帮助。

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cloudwin

很实用。谢谢啦。

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很好的交流

cao1976