[转移贴]提取黄瓜花叶病毒的dsRNA

cao1976

原贴由mimisikai再生 发表于 2007-8-17 08:03

这个是我们实验室提取dsRNA的经典方法，比较成熟好用
CMV应该很好提阿，他们很多人都在提，我也帮着做过几次，效果很好，方法如下，这个是小抽，有些细节需要注意，原理很简单，细胞破碎后，取核酸先吸附后洗脱，大抽可能更容易但比较费时
dsRNA提取操作方法如下：
1) 称取0.5 – 0.6 g去脉的鲜叶组织，在液氮中充分研磨；
2) 加入0.5 ml 2 × STE（pH8.0），15 µl β-巯基乙醇，0.3 ml饱和酚，0.2 ml三氯甲烷，70 µl 10% SDS，充分匀浆5 min；
3) 4ºC，12000 rpm，离心5 min，收集上清；
4) 上清用无水乙醇调至乙醇终浓度为17%的混合液，充分混匀；
5) 称取0.06 g纤维素（CF-Ⅱ，Sigma）加入1.5 ml离心管中，用含16%乙醇的1×STE浸泡1 – 2 h，12000 rpm离心1 min，弃上清；
6) 组织上清混合液加入到含有纤维素的离心管中，充分匀浆5 min；
7) 4ºC，12000 rpm，离心5 min，弃上清；
加入1 ml含有17%乙醇的1 × STE混合液，匀浆5 min；
9) 4ºC，12000 rpm，离心5 min，弃上清；
10) 重复步骤8）、9）4次；
11) 加入0.3 ml不含乙醇的1×STE，充分匀浆5 min，
12) 4ºC，12000 rpm，离心5 min，收集上清；
13) 加入0.3 ml不含乙醇的1 × STE，重复步骤12）、13）；
14) 收集的上清加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10 min；
15) 4 ºC，15000rpm，离心15 min，弃上清；
16) 用150 µl 70%乙醇洗沉淀，稍离后，弃上清，真空干燥3 min；
17) 沉淀溶于20 µl TE；
1 取5 µl在1% 琼脂糖凝胶上电泳，初步比较样品中携带dsRNA的情况，然后在5%的PAGE胶上电泳，进一步观察dsRNA条带的数目及比较分子量的大小；
19) 根据电泳所显示的双链RNA条带的大小，确定待检测病毒基因组RNA并与已知RNA病毒的dsRNA或相应DNA分子量Marker进行比较，初步诊断待检测病毒种类。

cao1976

zyj83114 发表于 2009-4-12 11:04 ：请问如何确定所提的产物就是dsRNA呀？dsRNA大小条带是不是跟所提dsRNA所对应的病毒基因组大小一致呀？