看得见的蛋白互作新技术Duolink PLA

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现今，科技发展的齿轮正在高速运转，每隔2-3年就会出现一个重大的技术变革引领生命科学走向更精细、更微观、更真实的水平，这其中也包括蛋白的研究。在疾病的致病机理、分子机制、信号通路、药物筛选以及新型诊断标志物的发现中，传统的蛋白研究“金标准”方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等已呈现出很大的局限性。
  
你可能在实验中遇到过以下问题：
WB方法灵敏度较低，无法检测低丰度、瞬时表达的蛋白；
Co-IP方法无法检测蛋白之间的微弱相互作用及间接相互作用；
蛋白过表达或融合标签后会改变其原有的功能，造成假阳性等结果；
非内源性表达，无法反应真实的状态，结果无说服力；
……

这表示，你目前使用的蛋白检测方法已无法满足研究所需的技术要求，是时候跟上蛋白研究技术变革的脚步，找到合适的新方法！看得见的蛋白互作新技术Duolink® PLA®加速了蛋白研究新发现。该技术可将蛋白信号放大1000倍，实现单分子级别的灵敏度。即便是微量样本、微弱互作、极罕见的低丰度表达，也能在内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量。更关键的是该技术操作简单，仅需一天！

Duolink® PLA® 技术至今已在肿瘤学、神经生物学、免疫学、病毒学、表观遗传学、生殖发育、组织病理学、心血管、代谢等研究领域进行了广泛报道。下面针对不同方面的应用实例进行简单分享。

应用1：蛋白瞬时相互作用检测，解决Co-IP技术无法实现的应用

在肿瘤学研究过程中，很多蛋白的相互作用过程并不是稳定的，而是动态变化和瞬时产生的，下图是一篇肿瘤血管生成的研究，显示VEGF刺激前后的不同时间，Duolink PLA技术能够原位检测内皮细胞中VE-PTP与VEGFR2复合物的相互作用，每一个红点代表一个相互作用的复合物，蓝色代表细胞核。作者通过PLA技术发现VEGF以瞬时作用方式调控VE-PTP和VEGFR2复合物的形成，文章显示用传统的Co-IP方法无法检测VE-PTP与VEGFR2的相互作用。此外，由于PLA是细胞内源性水平检测，因此这种相互作用结果更加真实，作者也通过PLA技术发现了VE-PTP在血管生成中具有重要的功能。

应用2：微量细胞中的微弱蛋白互作检测，解决Co-IP技术无法实现的应用

在神经生物学研究中，很多时候研究的起始材料包括细胞、组织等非常微量，同时相互作用的蛋白也很微弱，超出了传统方法如CO-IP的检测灵敏度。DYX1C1是阅读障碍的易感基因，与神经元迁移有关，但并不清楚他们之间的功能与相关性。下图显示原代大鼠胚胎海马神经元使用雌二醇培养48h，PLA检测雌激素受体ERs/DYX1C1在神经突触中的相互作用（A，D为雌二醇（E2）刺激组，B,E 为未刺激组，C，F为无抗体阴性对照），每一个红点代表 ERs/DYX1C1相互作用的复合物，蓝色代表 Hoechst 染细胞核，绿色代表Actin蛋白。作者使用传统Co-IP方法并没有在胚胎神经元中检测到相互作用的复合物。通过PLA技术，对DYX1C1的功能有新的理解，发现了神经元迁移、阅读障碍与雌性激素信号通路的联系，从而影响脑发育，调节认知功能。

应用3：病理组织中蛋白相互作用的原位检测，解决IHC无法实现的应用

在肿瘤的靶向治疗过程中，BRAF是非常重要的药物靶点，很多肿瘤都存在BRAF(V600)的突变，很多药物都是针对这个位点，但是逐渐增加的药物抗性让大家迫切希望能够进一步发现新的药物靶标，和传统药物联合治疗，进一步提高药物治疗效果。下图是发表在Nature上的文章，从药物产生抗性的机理出发，针对抗性相关的信号通路中共同的复合物eIF4F，开发了PLA原位技术在细胞以及临床的病人病理组织样本进行大量的检测。下图显示与anti-BRAF治疗前的肿瘤相比，eIF4F复合物的形成比率在免疫应答的肿瘤中降低，在抗药性转移的肿瘤中复合物形成比率升高，图中每个棕色的点状信号代表一个相互作用复合体。因此eIF4F 能够作为先天（innate）和获得性（acquired）抗性的指示器，也能作为抗肿瘤治疗的靶标，通过封闭eIF4E–eIF4G相互作用或靶向 eIF4A，能够抑制eIF4F复合物的形成，从而协同抑制BRAF(V600)，消除肿瘤细胞。PLA技术作为病理组织学研究的第二代新技术，在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精确性，是传统IHC实验无法实现的，能够建立高质量的病样组织标本库。

应用4．可视化检测蛋白相互作用与翻译后修饰，解决IF技术无法实现的应用

在很多相互作用和蛋白修饰的研究中，我们不仅希望发现两种蛋白的相互作用或是蛋白的翻译后修饰，我们更希望能够观察到这种相互作用，对这种相互作用准确定量。下图文章是将PLA技术与流式技术结合，通过蛋白之间的相互作用及翻译后修饰研究，为肿瘤提供新的预后标志物。下图显示PLA技术结合流式，能够在不同类型细胞中对EGFR与HER2 的同源和异源二聚体的相互作用进行定量检测，然而IF与流式结合无法对二聚体进行准确定量。此外，细胞在EGF刺激后，二聚化模式和磷酸化状态发生了变化，EGFR和HER2在不同细胞系有很大不同，PLA能够对EGFR的激活进行可视化研究，但IF无法观察到EGFR的激活，图中红色为PLA检测的磷酸化的 EGFR 蛋白。因此PLA技术与FCM的结合能在单细胞水平为蛋白相互作用和翻译后修饰提供更为强大的方法，能够为恶性肿瘤的治疗提供预后靶标。

应用5．单细胞水平检测组蛋白的修饰进行分析，解决ChIP研究中无法实现结果的应用

表观遗传学是当前一大研究热点，而ChIP又是表观遗传学中最重要的技术之一，它能帮助研究者很好地理解组蛋白修饰在基因调控中的作用，但ChIP无法应用于单细胞水平。下图这篇发表在Nature上的文章，将PLA技术与原位杂交（ISH）技术联合起来开发出新的ISH-PLA技术，可在石蜡切片的组织样本中，对特定类型单细胞中的特定基因位点的组蛋白修饰进行可视化研究。图中箭头表示在人颈动脉和脑组织中的组蛋白修饰的PLA信号。研究发现在人和小鼠的组织中MYH11位点的H3K4me2被限制在平滑肌细胞中，ISH-PLA 能准确、特异性地检测人和小鼠组织中单个细胞的特定基因位点的组蛋白修饰。该研究第一次在复杂的多种类型细胞存在的完整组织样本中，在内源性水平鉴定了特定细胞和基因位点的组蛋白修饰，显示在体内SMC细胞中MYH11基因H3K4me2独特和重要的表观特征，表明PLA技术可以很方便地适用于单细胞水平组蛋白修饰和多个基因位点的检测。

应用6．高通量蛋白互作检测，药物筛选和靶标验证新方法

药物研发过程中很大的一个障碍是很多临床前筛选的药物由于在临床使用中达不到预期效果或由于严重的副作用导致药物无法获得批准，占据了很高的研发费用。虽然高通量的化合物筛选能显著提高药物的筛选能力，但并没有获得很高的开发成功率。因此，急需一种方法能够鉴定生物学相关复合物，在药物研发早期能更精确地预测体内效应。

下图文章基于药物在信号通路中的效应开发了高通量的PLA筛选技术，通过前期鉴定的激酶抑制剂文库进行高通量筛选。通过对 PLA技术筛选在激活的原代人成纤维细胞中能够抑制PDGF受体信号通路的复合物，在80个复合物文库中发现13个能够作为潜在候选（hits），这些复合物的剂量效应检测显示具有很高的Z’ factor(0.71)和信噪比(11.7)，具有很高的抑制特定信号通路的能力。与磷酸化PDGF受体的免疫荧光(IF)检测进行比较，显示出PLA对受体磷酸化抑制效果的检测具有更高的检测效率。PLA药物高通量的细胞内原位检测，能对抑制剂诱导的PDGF信号通路中蛋白相互作用进行准确定量，结果更真实，筛选效率更高。

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参考文献
[1]Mellberg S, Dimberg A, Bahram F, et al. Transcriptional profiling reveals a critical role for tyrosine phosphatase VE-PTP in regulation of VEGFR2 activity and endothelial cell morphogenesis[J]. Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
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[6]Leuchowius KJ; Jarvius M; etc. High content screening for inhibitors of protein interactions and post-translational modifications in primary cells by proximity ligation[J]. Molecular & cellular proteomics : MCP, 2010, 9(1):178.