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GST-pull down 实验步骤

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发表于 2017-4-25 08:47:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
1. 大量制备GST蛋白
   1) 活化冻存菌种GST和GST-X:按1:50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5mlLB(Amp+),37℃,140~150rpm培养过夜
   2) 将过夜培养物按1:100比例接入200mlLB(Amp+),220rpm,30℃培养至OD600=0.4-0.6
   3) 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。(IPTG 0.5mM,20℃,150rpm培养10~16小时)
   4) 诱导适当时间后,4℃,5000g离心10min后弃上清。(如需要该步沉淀能保存在-80℃)
   5) 重悬沉淀:10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬
   6) 冰上超声沉淀重悬液:2S 间隔1S 至悬液透明(一般可容性蛋白:10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明)
   7) 10,000g,10min离心上清转移至新的离心管,加DTT至终浓度1mmol/L
2. 谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理
   1) 轻轻颠倒树脂盛装容器,混成匀浆
   2) 取适量匀浆放入离心管中,4℃,500g离心5min后弃上清(每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆)
   3) 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS,颠倒混匀后,4℃,500g离心5min后弃上清(50ul初始匀浆用400ulPBS洗)
   4) 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS,制成50%匀浆,颠倒混匀置冰上放置待用。(50ul初始匀浆加入40ulPBS)
3. 结合GST蛋白
   1) 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合,4℃轻摇30min(可过夜让其充分结合)。
   2) 4℃,500g离心5min后弃上清
   3) 沉淀加入10倍床柱体积PBS(1床柱体积=0.5*50%匀浆体积)(50ul初始匀浆用400ulPBS洗),颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白(每次可在混旋仪上混匀5min)
   4) 4℃,500g离心5min后弃上清
   5) 重复步骤3和4两次,共三次
4. 预清除细胞裂解液
   1) 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。(需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于1×106~1×107个细胞的裂解液。)
   2) 离心,4℃,13,000rpm,2min
   3) 将上清转移到新的离心管中
5. 探测细胞裂解液
   1) 设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中,4℃翻转混合孵育2h(时间可适当延长,如过夜以让其充分结合)
   2) 离心,4℃,13,000rpm,2min
   3) 用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤,4℃,13,000rpm,2min,弃上清,重复洗三次
   4) 加入50ul的2×Loading Buffer。轻弹混匀,沸水煮5~10min,离心后收集上清。

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