[转移贴]噬菌体展示技术在抗原表位研究中的应用

cao1976

原贴由xiazhaohe发表于 2007-12-14 11:27
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确定抗原表位，包括表位的序列和构象，是免疫学家感兴趣的一个问题。表位的确定不仅可以了解有关免疫反应的众多信息，为进一步人工控制免疫反应奠定基础，而且对药物合成、疫苗设计等也具有指导意义。确定表位常用的方法有：还原法、蛋白印迹法、肽扫描、突变分析等，后两种方法还同时解决了蛋白分子一级序列问题。但这些方法大多困难而繁琐。
      近几年来，噬菌体展示技术成为探测蛋白空间结构、探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻找高亲和力和生物活性的配体分子的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗等研究领域产生了深远的影响。肽库（peptide library）的应用为确定表位序列以至其构象提供了另一有力工具。
      噬菌体展示肽库是以噬菌体外壳蛋白PⅢ或PⅧ基因为载体，插入一段编码外源短肽的基因片段，噬菌体的浸染能力不受到影响，而外源短肽亦可在噬菌体表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空间构象。1990年Scott将随机短肽与丝状噬菌体的表面蛋白PⅢ融合，并展示在噬菌体表面，首次建立了噬菌体随机肽库。
      从噬菌体展示随机肽库中筛选抗原表位的基本原理是生物淘选（biopanning）。以单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例，其基本技术流程如下：将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体展示肽库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再进行下一轮筛选。通常经过3、4轮的筛选，并且每次增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，就能推知该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定该单抗所针对的抗原表位。
      借助于噬菌体展示肽库技术，已经成功分析了多种蛋白质抗原的表位，如HIV（Keller et al., 1993； 杜勇等，2000）、HBV、HCV（杜勇等，1999；Francesca et al., 2001；潘卫等，2001）、日本血吸虫（欧阳理等，2002）等，说明完全可以利用随机肽库鉴定抗原的线性和构象表位，大大简化了重组免疫原的克隆、鉴定和表达等过程，为表位鉴定研究增添了新的手段。
      丝状噬菌体具有免疫原性，无须佐剂即可产生抗体，这意味着噬菌体展示系统可以作为候选疫苗抗原表位的递呈工具。利用展示肉毒梭菌中和表位的噬菌体不加佐剂直接免疫小鼠，血清ELISA检测显示，免疫小鼠是对照小鼠的OD值的2~10倍。表明噬菌体展示的表位具有明显的抗原性。
噬菌体展示技术的优点 噬菌体展示技术作为一种新兴的研究方法和工具，在研究蛋白质结构上已被广泛应用。它具有很多显著的优点，如：
A. 高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达1011 PFU），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。
B. 可用于模拟表位的筛选 利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多（Giuseppe, 2001；Seshi et al., 2002；Ouyang et al., 2003）。李全喜等（1997）利用单抗9E10筛选噬菌体随机肽库，结果获得了两个阳性克隆，其中一个与抗原天然序列同源，而另一个则完全不同（即为模拟表位）。模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。
C. 易于纯化 重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。目前用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13单链噬菌体。由于M13噬菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
      尽管如此，在噬菌体展示技术中仍然存在一些不足。首先，目前所建的肽库容量只能达到109，要想构建大片段的肽库很困难。其次，需要解决肽库的多样性问题。第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。作为一种新技术，类似的具体问题还很多。但这些暂时的缺点并不能掩盖其巨大应用潜力。