[转移帖]病毒载体在疫苗研制中的应用

cao1976

原贴由论坛会员Rojjer发表于 2008-3-31 16:58 |

病毒载体在疫苗研制中的应用(摘译自：Expert Review of Vaccines 2007,6(2):255-266）


[摘要] 对抗原/基因投递系统的杰出探索使新型预防性和治疗性侯选疫苗的研制成为可能，本文综述着重地介绍了不同的抗原投递系统，尤其是病毒载体，并对在对抗艾滋病和疟疾方面使用所涉及的基本技术进行了评论。尽管这类重组载体可能面临广泛的临床前试验和严紧的法规要求，但其中一些载体可从亲代疫苗的精湛工艺和临床试验中获得裨益。重中之重是以活重组载体为基础的新型疫苗要在可接受安全性情况下具有可诱导广泛强烈和持久的免疫应答的作用。

当前研制预防性疫苗的观念
      所有疫苗必须安全并具有免疫原性，特别是能够诱导针对介导长期免疫的合适免疫应答类型，对新型疫苗研制而言，更重要的是必须适合大规模生产和应对所有相关的法规问题。
      有关病毒疫苗研制的多种方法如下，概念包括：
      ·亚单位疫苗由含佐剂的可溶性抗原混合物构成，其中一些疫苗用液体制备（以脂质体和病毒体为基础的疫苗）；
      ·灭活疫苗通常利用化学试剂，例如福尔马林或β-丙内酯，在不破坏病毒包膜蛋白的抗原性的情况下灭活病毒；
      ·减毒活疫苗是非致病病毒形式组成。
      灭活病毒疫苗生产相对便宜，但往往免疫原性差，仅提供短期免疫；含佐剂的脂质体疫苗安全，能提供中到长期免疫原性，但价格昂贵；相比之下，减毒活病毒疫苗有效（例如口服小儿麻痹，麻腮风及痘活疫苗），在安全性得到证实的情况下通常提供长期免疫，使它们用于常规婴儿免疫计划，其能进行大规模生产，因而对于世界范围的大量接种来说，减毒活病毒疫苗是高性价比的疫苗。
      因为原理简单，具有日益增长的美好前景，用病毒作为基因投递载体对抗疾病的想法极富吸引力。而研制对抗艾滋病和疟疾的有效疫苗的失败尝试促使广泛研制创新型病毒载体，以便能进行有效的投递抗原诱导免疫应答。预防性疫苗使用以不同的DNA和RNA病毒为基础的携带体作为投递载体。
      如何达到安全性和免疫原性之间的理想平衡是所有减毒活疫苗再度面对的关键性问题，因此，大多数具有复制活性的病毒载体进行人体临床试验被认为是不安全的。若干DNA和RNA病毒经过遗传学改造，使其复制能力缺失，其中一些，比如以复制缺陷型痘病毒和腺病毒为基础的载体已经确定用于生产并进行了第一次人体临床试验，主要考察其安全性，在一定程度上考察其免疫原性。另一方面，持续关注复制活性不足的病毒载体是否能激发对抗像艾滋病和疟疾等疾病的有效长久免疫应答。来源于商业减毒活疫苗的有复制活性的病毒载体为研制兼顾良好的安全性和免疫原性的新型疫苗提供了希望。
      因为小儿麻痹疫苗，麻疹风疹腮腺炎联合疫苗和水痘疫苗这些认可的减毒活病毒疫苗的优良特性，一些被考虑设计成减毒活病毒载体，然而遗传学改变的减毒活疫苗在被允许进入临床试验前，将面临严密的法规问题，主要关注可能集中于诱发重组疫苗向性改变所带来的潜在风险。涉及目前麻疹风疹腮腺炎联合疫苗接种方案，以重组麻疹疫苗为例，显示了一个严重问题，即这类新型载体如何获得许可，而另一个缺点是在成年人中普遍存在抗载体免疫，对小儿麻痹病毒，痘病毒和麻疹病毒的固有免疫不利于使用这些病毒做载体。但是，还不清楚固有免疫是否对所有载体普遍存在，先前已证实再次接种后，针对麻疹病毒的固有抗体不会抑制细胞和体液免疫。
      来自非人类病毒的基因工程载体，不易在人群中的流行，另外来自终止疫苗的病毒的基因工程载体同样有吸引力，但由于这些病毒在自然界中并不存在，在安全法规层面可能普遍存在不清楚特性和潜在问题。
      以气溶胶形式使用的疫苗对气溶胶型重组疫苗的研制格外关注，对在病原体进入部位携带的抗原（例如人免疫缺陷病毒），它们有激发黏膜免疫应答的潜力。侯选重组疫苗的黏膜给药被认为能够克服全身性抗载体的固有免疫，在已免疫人群中进行的麻疹疫苗和麻疹水痘联合疫苗的黏膜给药相对于皮下接种，表现出安全性和更有效性，气溶胶型麻疹疫苗正被世界卫生组织积极关注着，尽管如此，基于安全问题，通过气溶胶形式接种重组疫苗可能不被广泛应用。因此，为了满足法规标准，黏膜投递可能需要进行更长时间的临床试验。

侯选疫苗的先决条件
      除经证实的有效性和安全性，对每种疫苗来说，先决条件是适合大规模生产，同时在病毒多次传代，甚至是疫苗注射后及接种~的残余增殖中，保持病毒（载体和转基因）的遗传稳定性。此外，有效的病毒载体应具有激发免疫系统多重防御的潜力，同时这种免疫原性应是持久的。
      目前，多种重组病毒载体没做临床前和早期临床研究，每种特定的技术平台在推荐应用时显示出一些优良特性和潜在局限性，本文综述涉及对一些很有希望的病毒载体的讨论。

病毒载体：技术，特性和免疫原性
      腺病毒载体
      从原型血清型2和5（目前大多数腺病毒载体都是以此为基础的）中获得的人腺病毒在人群中有高流行性。腺病毒是稳定的无包膜二十面体病毒，具有一条大约38kb的线状双链DNA基因组，可编码30多种蛋白，在广泛范围的细胞中不经病毒基因组的染色体整合可自行复制。至今，描述了六个属中的51种血清型，儿童中被报道的上呼吸道疾病，5%-10%由腺病毒2型和腺病毒5型引起。
      E1缺失的重组腺病毒（rAd）载体由于无早期E1A和E1B的转录单元，可以插入5kb的外源DNA，另外去掉E3可以插入8 kb的外源DNA。通过重组使这些病毒失去复制功能，用E1完全细胞293或PER.C6细胞繁殖，改良最新的细胞系消除细胞E1基因和载体随机复制可能存在的同源重组。重要的是，病毒基因组表现出的遗传稳定性高于使用的这类载体。尽管在接种对象体内，E1缺失的腺病毒载体有效投递和表达了携带的转基因，但实质上也激发了抗载体的免疫，因此接种和基因疗法还存在局限。
      复制缺陷型重组腺病毒载体临床前试验显示得到高滴度细胞溶解性T细胞应答，因此获准进入临床试验来抵御艾滋病，并在半数以上参与研究的志愿者体内产生了持久性HIV-1特异性CD8+细胞应答，包括干扰素γ，白细胞介素-2和肿瘤坏死因子α。目前，一项关于三价艾滋病侯选疫苗的Ⅱ期临床研究在高危人群中进行（由默克公司和国立过敏传染病研究所发起），然而，由于人体对腺病毒5型普遍存在的固有免疫（西方世界为50%，非洲撒哈拉和亚洲东南部90%以上），需寻找替代方法。关于这点，以重组腺病毒5型为基础的免疫策略，研制在人群里低流行的新型腺病毒载体和嵌合腺病毒载体，增加重组腺病毒5型疫苗剂量仅能一定程度减少由腺病毒5型引起的固有免疫。另外，以腺病毒为基础的疫苗的黏膜A给药显示可在黏膜表面激发免疫应答，然而，考虑到黏膜途径投递腺病毒5型严重安全性问题，没有进行人体试验。以DNA为基础，腺病毒5型加强免疫的给药在低水平抗载体免疫时有效。虽然从少有血清型中获得的重组腺病毒载体，像腺病毒35型或腺病毒11型能够激发对腺病毒5型载体存在固有免疫的动物的免疫应答，但在未免疫动物身上激发的免疫应答相对于腺病毒5型的强度低。最近，有显示通过将腺病毒5型衣壳蛋白中和决定因素序列和一种少有腺病毒血清型的相应序列置换改造重组腺病毒5型载体，避免了抗腺病毒5型免疫，同时保留腺病毒5型的高免疫原性。到目前为止，另一种避免抗载体固有免疫的方法是利用有复制活性的腺病毒载体或非人无复制活性腺病毒（例如来源于黑猩猩）。然而这些载体在进入临床试验前急需分析以通过重要的法规障碍。
      痘病毒载体
      痘病毒是一类基因组大小为150-300kb的双链DNA病毒，DNA的复制发生在胞质，首株重组活疫苗是以牛痘病毒作载体为基础研制的，痘病毒载体容易进行遗传学处理，通常生长至高滴度，冻干后性质稳定。然而，安全性问题促进研制可复制病毒载体，改良复制缺陷型牛痘病毒Ankara（MVA）载体和高度减毒牛痘病毒株（NYVAC）载体已经通过多重基础-加强的策略在灵长类里进行了试验，目前正进行人类志愿者中的Ⅰ/Ⅱ期试验评估。当前临床试验中使用以改良复制缺陷牛痘病毒Ankara（MVA）载体或高度减毒牛痘病毒株（NYVAC）载体为基础的疫苗，有待证实是否达到与使用腺病毒载体疫苗做人体试验的报道相似的免疫水平。金丝雀痘病毒(ALVAC)载体和禽痘病毒(FPV)载体因为在人体内存在先天复制缺陷，临床试验中也进行评估，以金丝雀痘病毒(ALVAC)载体和禽痘病毒(FPV)为基础的病毒载体不存在固有免疫带来的潜在限制，尽管在过去的临床试验中发现以重组痘病毒为基础的疫苗存在较低的免疫原性，但采用异源为基础-加强注射用药，这类载体仍可作为加强成分引人注目。
      α病毒载体
      Sindbis(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)都属于披膜病毒科家族。α病毒是一类具有正链的单链RNA病毒，基因组长度约为12kb。α病毒和衍生的载体可传染的动物和哺乳动物的细胞类型范围很广，短时间内能表达大量病毒和异源蛋白，复制仅在胞质中进行，而胞质组成一个确保生物安全性的重要结构。人群中完全不存在抗载体免疫，以及提到的α病毒的有利结构，它们对重组载体的研制是很有用的。
      以α病毒衍生的复制子为基础的侯选疫苗采用异源基因代替病毒基因的基因工程的方法产生，复制子包裹形成病毒状颗粒，大规模生产所需的结构蛋白由幼仓鼠肾细胞以反式表达，虽然这些载体保留了表达基因和在细胞中复制的能力，但丧失了感染相邻细胞的能力，因此它们被称为单循环载体。有趣的是，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒衍生的复制子颗粒和遗传学改造SIN病毒为基础的复制子颗粒显示能和专门的抗原呈递细胞相互作用，例如树突状细胞。表达来自于广泛病原体抗原的重组α病毒载体在不同的动物模型系统中被广泛研究。委内瑞拉马脑脊髓炎病毒复制子显示能激发灵长类对猿猴免疫缺陷病毒（SIV）的保护性免疫应答。用α病毒衍生的载体所做的临床试验将说明一种委内瑞拉马脑脊髓炎病毒复制颗粒疫苗如何编码一个分化C型HIV-1的gag基因（艾滋病病毒疫苗试验网络），α病毒复制子颗粒商业化生产可能存在的法规障碍是需要具有现行良好的药品生产管理规范水平的细胞系，而且扩大规模的工艺过程的稳定性特别关注。
      腺病毒相关病毒
      腺病毒相关病毒（AAVs）属于细小病毒家族，是一类基因组为4.7kb的单链DNA无包膜病毒，需要依靠辅助病毒进行复制。虽然到目前为止，腺病毒相关病毒和人类疾病没有关联，但从11种血清型（从人到灵长类动物）中发现存在腺病毒相关病毒特异性抗体（特别针对腺病毒相关病毒2型），人检出率为70%-80%。
重组腺病毒相关病毒载体（rAAVs）能在广泛组织里激发转基因表达。与野生型腺病毒相关病毒不同，由于缺失重复性回文基因，重组病毒不能把它们的基因整合到宿主细胞染色体的腺病毒相关病毒S1安全位点，但可将DNA随机插入宿主细胞基因组中，导致肿瘤抑制基因不表达。重组病毒基因的基本组成是一个5kb的有限插入能力的表达框，有野生型病毒的反向末端重复序列。因此，病毒颗粒的产生需要依靠细胞的Rep，Cap及反式病毒辅助功能的贡献。包括采用层析仪色谱纯化，研制侯选疫苗对人类临床应用来说是可能的。临床前，肌肉注射表达猿猴免疫缺陷病毒抗原的重组腺病毒相关病毒可激发针对该抗原的持久保护性抗体和T细胞应答，在靶向遗传学和国际艾滋病疫苗倡导的影响下，研制出对抗艾滋病的侯选重组病毒颗粒疫苗，已通过欧洲和印度的Ⅰ期临床试验，现在非洲正进入Ⅱ期临床评估。
      麻疹病毒
      麻疹病毒（MV）属于副粘病毒科家族中的麻疹病毒属，是一种由未分段的线状单链RNA组成的含15，894个负极性的核苷酸的有包膜病毒，减毒活麻疹病毒疫苗已经用于数以亿计的人体免疫，在安全性和有效性上表现不俗。麻疹病毒疫苗接种能激发持久的免疫应答，带来长期的保护作用，遗传性稳定同时无致病性的返祖现象。和野生型毒株不同，减毒毒株被认为不会持久存在于接种个体体内。
      用表达麻疹病毒蛋白N，P和L的质粒的全长抗原基因组质粒共转染哺乳动物细胞建立了麻疹病毒感染性克隆，这项技术允许麻疹基因组调控和把其他基因插入麻疹基因组得到重组麻疹病毒成为可能，标记基因（绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶）和B型肝炎病毒、猿猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、WNV病毒、SARS病毒的异源基因一样，也可被重组麻疹病毒表达。rMV的遗传稳定性也能传许多代病毒，由于缺少整个麻疹病毒繁殖周期的DNA中间产物，加上严格的细胞复制，麻疹病毒无法整合到宿主细胞的染色体中，生长动力学或许延迟但不会影响整体的终点滴度，这点和其亲代疫苗（使用常规麻疹病毒生产方案）极其相似。最初的重组麻疹病毒是以过度减毒麻疹病毒Edmonston B毒株为基础，此后，研制出由临床批准并销售的麻疹病毒疫苗毒株衍生的重组麻疹病毒疫苗载体。与麻疹病毒不同，Schwarz毒株用鸡胚成纤维细胞培养，麻疹Edmonston Zagreb疫苗采用人二倍体细胞培养。因此，将疫苗引起的过敏反应的可能降到最小，注射部位较少出现炎症，气溶胶型麻疹病毒Edmonston Zagreb疫苗（在墨西哥学生中使用）有效安全，抗麻疹病毒抗体血清和黏膜抗体明显高于其他注射型疫苗。
      给实验动物注射一剂表达HIV-1-env衍生物的重组麻疹病毒后，显示能激发人免疫缺陷病毒中和抗体。由MV诱导的有效免疫应答可能是因为麻疹病毒感染专职性抗原呈递细胞（树突细胞和巨噬细胞），这点被麻疹病毒免疫学多次报道所证实。一种由重组麻疹病毒表达的HIV-1CTL多表位抗原在对麻疹病毒感染敏感的人类转基因小鼠体内得到有效的细胞免疫应答。用表达一种属于HIV1型有包膜糖蛋白的分泌性抗原的重组麻疹病毒对预先已免疫麻疹病毒短尾猿免疫两次，该试验有效证实了猿猴免疫缺陷病毒/人免疫缺陷病毒抗原不能整合入麻疹病毒颗粒，因此不会影响病毒的趋向性。尽管存在预先麻疹病毒特异性免疫，但是还能检出高滴度抗HIV抗体应答。用表达WNV外膜糖蛋白的分泌型变异体重组麻疹病毒免疫转基因小鼠，小鼠在高剂量WNV攻击下存活。值得注意的是由重组麻疹病毒激发的抗麻疹病毒体液应答的程度和性质与常规麻疹病毒相似，因此，二价或多价重组麻疹病毒疫苗有望取代用于儿童和成人免疫的常规疫苗。然而，从法规和行政许可的角度来看，取代目前被广泛接受的麻腮风疫苗中麻疹病毒成分是否可行仍有待观望。气溶胶型麻疹疫苗成功的临床试验为激发黏膜免疫的侯选重组麻疹病毒EZ疫苗已铺路。气溶胶型麻疹疫苗的临床数据说明这种使用方式可能避开由常规麻腮风疫苗引起的全身抗麻疹病毒固有免疫。特异性体液应答（免疫球蛋白A抗体）能在黏膜部位中和性传播病原体方面起作用。使用的特别途径可能很经济，简化将来大规模接种规划。
      泡状口腔炎病毒
      泡状口腔炎病毒是一种含单链反义RNA基因组（11kb）的弹状病毒，通常感染驯养动物（马，牛，猪）患一种不易致命的疾病，一般是印第安纳泡状口腔炎病毒或新泽西泡状口腔炎病毒，泡状口腔炎病毒是一种动物传染的病原体，被感染的节肢动物作为媒介把病毒从一个宿主转移到另一个宿主，感染人的事件很少，一般无症状。然而，1988年报道的一例脑炎的病例增加了对该病毒的警惕。但总体上，人群中发现的抗泡状口腔炎病毒血清阳性很低。
      运用反向遗传学，泡状口腔炎病毒的序列同麻疹病毒一样通过互补DNA得到。该病毒基因组也可加入其他编码异源抗原的外源基因，重组泡状口腔炎病毒载体有高滴度和稳定的遗传学性质。其仅在被感染细胞的细胞质中复制，同时病毒核酸（RNA基因组和抗原基因）不和染色体DNA重组。
      以表达HIV的env基因和gag基因的减毒活泡状口腔炎病毒载体为基础的艾滋病侯选疫苗在猿/人免疫缺陷病毒和短尾猿模型上成功进行了试验。用人免疫缺陷病毒89.6P攻击重组泡状口腔炎病毒免疫的动物，其在14个月内都没致病，最近的报道称，这种状况可维持5年，并能激发重要的CD8+T细胞应答和中和抗体。相对肌肉注射，鼻内给药能激发明显的更高细胞免疫应答和相似的体液免疫应答。仅肌肉注射单剂表达埃博拉病毒和马尔堡病病毒蛋白的重组泡状口腔炎病毒载体，就能激发非人灵长类动物体内的完全保护免疫应答，同时由于无载体脱落和无不良作用，证实这些疫苗是安全的。
      因为泡状口腔炎病毒属嗜神经病毒，黏膜使用重组泡状口腔炎病毒进行人临床试验上要考虑严重的安全性问题，幼鼠鼻内接种该疫苗，会引发脑炎。因此，必须改变泡状口腔炎病毒基因组中的基因或截短由泡状口腔炎病毒编码的G蛋白细胞质尾研制新一代载体，缺少整个G蛋白基因的泡状口腔炎病毒载体由在反式转录中去掉泡状口腔炎病毒G蛋白的细胞系繁殖。有趣的是，这种表达HIV-env的重组单向载体可激发与有复制活性的重组泡状口腔炎病毒相当的重要和有记忆性的CD8+细胞应答，但由于泡状口腔炎病毒G蛋白对大多哺乳动物细胞有毒害作用，产业化可能限制这种细胞系的发展。
      重组泡状口腔炎病毒-人免疫缺陷病毒载体的神经毒性和致病性在接受鼻内接种的短尾猿里得到评估，以中国国家标准来判定无病毒血症和染病症状，仅发现有少量脱落在鼻涕里。目前，泡状口腔炎病毒载体快要进入临床试验。
      其他未分段反链病毒
      许多由负链DNA得到的未分段负链病毒成为潜在的侯选重组疫苗。表达SIVgag和DNA基础的复制缺陷型仙台病毒（缺乏编码融合蛋白基因）使短尾猿免受猿/人免疫缺陷病毒及猿免疫缺陷病毒mac239的攻击。因仙台病毒的抗原性与人副流感病毒1型（HPIV1）相关，需考虑以仙台病毒为基础的重组载体对人副流感病毒1型血清阳性的人的免疫原性情况。
      人副流感病毒通过呼吸道感染，感染儿童患普通感冒到肺炎。采用反向遗传学，目前准备研制以人副流感病毒为基础的新型鼻给药减毒活疫苗载体。因人体不存在固有抗载体免疫，以Newcastle病病毒或狂犬病病毒为基础的减毒活载体很有前景。但这些载体的研制因安全性问题面临广泛的法规障碍，由于亲代病毒高度嗜神经性可能使以狂犬病病毒为基础的载体受限。
       黄热病病毒
      黄热病病毒（YFV）是一种热病病毒，通过蚊子引发出血热病，常见于非洲撒哈拉地区和热带南美。黄热病病毒是一种小型的正极性基因组的单链RNA披膜病毒，在过去70多年里，减毒活疫苗（黄热病病毒17D）被用来免疫上百万人，该疫苗皮下单剂给药可以激发9个月以上的婴儿产生长期保护免疫应答。
      黄热病病毒载体能用来表达其他黄热病病毒的E蛋白，但是由嵌合病毒的一个热病病毒E蛋白代替了黄热病病毒E蛋白，这样，该疫苗不再是有效的黄热病疫苗，而是作为异源黄热病病毒疫苗。
      编码微生物或原生动物表位的基因序列插入到基因组的不同部位（例如插入到非结构区域或E蛋白的F/G圈）引起重组黄热病病毒17D产生能够激发体液或细胞免疫应答，该重组病毒疫苗研发的主要问题是插入基因的大小有限制（大约1.5kb）和整个转基因不稳定性和法规委员会要求严紧的安全性试验，因为这种嵌合病毒在自然界里并不存在，可能改变其嗜性。
      小儿麻痹病毒
      用减毒活Sabin小儿麻痹病毒株研制出的重组RNA病毒活疫苗载体（重组小儿麻痹病毒）已经在短尾猿身上做了试验。
      由于基因插入能力有限，仅有少量编码免疫原性片段的外源基因插入体能插入病毒基因组，编码小儿麻痹病毒蛋白水解位点序列作为侧翼，其他序列插入到编码小儿麻痹病毒外壳基因和非结构蛋白基因之间，新型免疫原被作为小儿麻痹病毒多蛋白的一部分被表达，在一种小儿麻痹病毒衍生的蛋白酶的作用下释放出来，重组小儿麻痹病毒整体遗传不稳定性对潜在的重组小儿麻痹病毒疫苗来说，是一个严重缺点，研究发现稳定性和插入外源基因的G/C含量有密切关系。
      给短尾猿鼻内和静脉接种表达猿猴免疫缺陷病毒抗原表位的重组小儿麻痹病毒，能激发猿猴免疫缺陷病毒特异性细胞、体液和黏膜免疫应答。在进一步研究中，设计出两组20种截短的有复制活性的表达猿猴免疫缺陷病毒中不连续重叠片段gag、pol、env、nef和tat的抗原序列的重组小儿麻痹病毒。值得一提的是，4/7的鼻内免疫的短尾猿（每个动物4剂量）对猿猴免疫缺陷病毒阴道攻击表现出足够保护性。利用小鼠对小儿麻痹病毒存在固有免疫对重组小儿麻痹病毒疫苗进行研究，结论为小儿麻痹病毒固有免疫对重组小儿麻痹疫苗载体不会造成严重影响。
      疱疹病毒
      单纯疱疹病毒1型是一种首先感染黏膜上皮组织的高致病性病毒，被感染细胞破裂后，病毒会感染感觉神经元，然后进入溶胞时期或潜伏时期，最可怕的是可引发致命性脑炎，单纯疱疹病毒由一条152kb大小基因组的双链DNA构成，基因组包含了81余个基因，至少编码84种多肽。通过删除其中非必需基因使40-50kb大小的外源基因插入。
      为了将单纯疱疹病毒1型制成载体，已产生两种基本方法，称为扩增子或重组病毒。扩增子通过一个细胞系的质粒转染得到，该细胞系需要辅助病毒在转录过程中提供结构基因和调控基因。单纯疱疹病毒1型扩增子载体用于基因治疗来对抗脑肿瘤和神经变性疾病，尤其是帕金森病。当使用异源疫苗载体，单纯疱疹病毒1型扩增子表达人免疫缺陷病毒1型gp120，能激发被免疫实验小鼠的细胞和体液免疫应答。
      单纯疱疹病毒1型复制缺陷型载体制备疫苗用来对抗人免疫缺陷病毒。以复制缺陷型单纯疱疹病毒载体为基础的表达猿猴免疫缺陷病毒Gag、Env和Tat-Rev-Nef溶解蛋白的疫苗，显示能有效激发恒河猴和短尾猿抗Gag和抗Env的细胞应答，用猿免疫缺陷病毒静脉攻击后，高峰值和12周血浆病毒血症水平都明显偏低。为保持有效免疫原性的同时减少细胞致病性，正研制以多重变异体为基础的新型单纯疱疹病毒疫苗载体。使用单纯疱疹病毒载体的潜在缺点是人群中及其普遍的抗单纯疱疹病毒固有免疫。另外，未来大量疫苗生产达到合适的单纯疱疹病毒滴度可能存在技术阻碍，在进临床试验前，当局将要求做广泛的临床前研究。

专家评论
      虽然报道裸露DNA和复制缺陷型载体作为预防性侯选疫苗取得了一定成功，但减毒活病毒被认为是最有吸引力的技术平台，确实，由这种载体激发的免疫原性非常高而且持久，而这些特性都是成功疫苗所必需的。另外，研制适合销售的疫苗要求该疫苗安全，能激发广泛和长久的免疫应答，同时避免抗载体固有免疫，并适合大规模生产及符合法规要求。
      被研究最多的载体是复制缺陷病毒载体（痘病毒和腺病毒），用表达同样免疫原的带佐剂的DNA、麻疹病毒A型和腺病毒5型做的比较研究表明单剂给药方式不够，异源性基础-加强方式可能是最有前景的。
      虽然用裸露DNA接种被证实有些效果，同时对给药者来说实用和安全，但供大量免疫接种的实行和昂贵的生产工序使该疫苗在第三世界国家使用受阻，DNA疫苗的一个被认知的缺点是其激发良好病毒中和抗体应答的能力有限。有待证实的是以活的病毒载体为基础的疫苗的大规模生产在成本上是否有竞争力。
      活的减毒病毒载体能够解决一些复制缺陷型载体引起的局限性，然而此法在进行临床试验前需要做大量临床前安全性试验，在有前景的载体中最明显的是麻疹病毒，因为其具有长久的安全性和有效性，同时其最可能投入大规模生产，成本和其亲代疫苗一样低。仅单剂麻疹疫苗就能激发强烈的细胞和体液免疫应答，特别是能有效促进长期记忆B细胞和T细胞介导的免疫，以上几点使其成为具有吸引力的减毒活重组疫苗研发的模型平台。

五年展望
      对抵抗未征服的疾病，如艾滋病和疟疾的疫苗的探索面临着前所未有的科学和人类挑战，未来的疫苗可能不提供完全保护但大大减少这些疾病带来的发病率和死亡率。大量多种多样载体的存在和有效的全球协作计划将实质性推动这类疫苗的研制。如麻疹病毒和泡状口腔炎病毒的活的病毒载体都有望成为迫切需要的新型侯选疫苗，就这点来说，我们期望在未来五年里，这样或类似的载体系统被研制出来进入Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，如果成功的话，这类载体将为多价活疫苗的全新时代铺平道路，和销售的减毒活病毒疫苗类似，但发展中国家能负担得起这种成本。未来五年的挑战将集中在用于接种的指定抗原、载体和推荐接种方案。在过去的十几年间，一些令人印象深刻的新型载体和有潜力的保护性抗原不断涌现，也促进了初步临床方案的优化和对在新的法规指导方针下安全性标准的界限和落实。下一步将涉及决定众病毒载体的有潜力工业化如何进行，包括生产能力和工艺稳定性。这些问题对那些会将疫苗学方面新型有效方法具体化，进入或即将进入临床研制尤为关键。