艾滋病HIV感染的主要检测方法之一：HIV抗体、抗原检测法

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目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。

　　抗体通常是在感染后3～8周能够被检测出来。目前，大多应用双抗原夹心法，这种方法具有很好的灵敏性和特异性。抗体检测由初筛和确认试验组成，初筛试验呈阳性的必须进行确认试验。酶联吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度，且操作简单、快速，适合对大量样品的检测。因此，是目前临床通用的初筛检测方法。国际上有3种确认试验方法，包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。

　　在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18 d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。

　　病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断。

　　病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。

　　一、HIV抗体、抗原检测

　　HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生，血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB)。常规实验方法：酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验(WestBlot)、间接免疫荧光法(IFA)。快速检测方法：明胶颗粒凝集试验、斑点免疫结合试验、Ｐ24抗原的检测、分子生物学方法、RTPCR检测法、荧光实时PCR检测技术、支链DNA（bDNA）、连接酶酶促链式反应(LCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)

　　（1） 酶联免疫吸附试验

　　ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。

　　（2）免疫印迹试验

　　免疫印迹试验主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDSPAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说，免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2％的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。

　　（3）免疫荧光试验(IFA)

　　基本原理为应用Ｈ9或HUT78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定，制备为抗原片,加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光下可见到细胞内有黄绿色荧光。

　　（4）明胶颗粒凝集试验(PA)

　　PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊设备,适合对少量标本的检测。

　　（5）斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)

　　斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体, 用HIV抗原包被于固相载体,加入待测标本(可为血清、血浆、尿液和其他),一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本,包被抗原和被检血清中抗体结合,用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白Ａ上,金标记蛋白Ａ具有与人Ig结合的能力,因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体,则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条),一般3～10 min出结果,特异性较好, 较为适宜于偏远地区临床用血检测,但不适于城市地区的献血员筛查。

来源：中华检验医学网