微流控芯片数字PCR技术及临床应用前景

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作者：潘小艳， 陶志华
单位：浙江大学医学院附属第二医院检验科

数字PCR(digital PCR，dPCR)是通过将微量样本做高倍稀释和分液，使每个反应单元含有不超过一个模板分子，再将所有样品进行PCR扩增，并对扩增结果以阳性或阴性直接计数统计分析的一种技术。最早由Vogelstein等[1]提出，但由于当时使用96孔板稀释样本，检测通量低，检测线性范围太窄，不能充分体现数字PCR技术的优势。

微流控芯片(microfluidic chip)指的是将化学和生物等领域中所涉及的样本制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块很小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学或生物实验室的各种功能[2]。微流控芯片能快速、准确地将样品分成若干个独立的单元，并进行多步平行反应，成本低、体积小、高通量，是目前理想的数字PCR平台[3]。微流控芯片数字PCR是采用微流控芯片将PCR反应液分割成数量众多且体积相等的反应单元，通过检测扩增后荧光信号呈阳性的反应单元的数量对核酸模板进行定量。最初使用的微流控芯片是采用刻蚀的阵列微池结构[4]，Ramakrishnan等[5]将微流控芯片微泵阀技术用于数字PCR，将检测通量大大提高，Tanaka等[6]将微流控芯片液滴技术用于数字PCR，将检测通量进一步提高。

一、微流控芯片数字PCR技术分类

微流控芯片数字PCR主要包括3个过程：DNA反应单元的生成(DNA样品在反应室中随机和独立分布)、PCR扩增和荧光信号分析。按照反应单元的生成方式将微流控芯片数字PCR主要分为阵列数字PCR和液滴数字PCR两大类。

1．微流控芯片阵列数字PCR技术：

即通过芯片设计将纳升级液体封闭在高通量的微池或微通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果的荧光显微镜直接判读。芯片设计有阵列微池式芯片、滑片式芯片和集成微泵阀式芯片等。阵列微池式芯片上刻蚀有微池阵列，反应液由进样孔直接导入各反应微池[4]；滑片式芯片是设计带有微流体通道和反应单元的玻璃芯片，上下两片玻璃芯片间用油相密封，通过滑动芯片将样品溶液从流体通道引入反应单元，同时生成成百上千个微反应滴阵列[7,8]；集成微泵阀式芯片是通过多层软刻蚀技术在聚二甲基硅氧烷芯片上加工交织的液体和气体通道结构，通过精确地控制微泵阀的开启和关闭，快速并准确地将流体分成若干个阵列的独立单元[5]。

2．微流控芯片液滴数字PCR技术：

微流控芯片液滴技术是将2种互不相溶的液体，以其中的一种作为连续相(油相)，另一种作为分散相(水相)，在水/油两相表面张力和剪切力共同作用下分散相以微小体积单元的形式分散于连续相中，形成液滴，常用作微反应器，具有体积小、样品间无扩散、反应条件稳定等特点[9,10]。微流控芯片液滴数字PCR是利用微流控芯片液滴技术一次生成数万乃至数百万个纳升至皮升级油包水液滴，液滴中包裹了单拷贝DNA模板和PCR反应液，将液滴收集在PCR反应管中进行扩增，PCR反应结束后将液滴取出在另一检测芯片上通过类似液滴生成的技术检测每个液滴的荧光信号，然后进行统计分析[6]。

二、微流控芯片数字PCR的优势

目前，数字PCR全部或部分功能单元需借助微流控芯片平台实现，因此在讨论微流控芯片数字PCR的优势时，通常与传统的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)进行比较[11]。

1．准确性高：

数字PCR在进行扩增反应前将PCR溶液分配到大量的独立反应室，PCR反应结束后直接计数有荧光信号的个数。通过合理设置产物的荧光信号阈值，能很好的区分各反应室有无扩增产物，基本不受扩增效率的影响。将不同的扩增体系使用不同的染料标记，通过稀释分离使每个反应室仅含一套扩增体系，消除了本底信号的影响，可从复杂背景中检测出目标分子，具有很强的特异性。

2．最低检测限低：

将含有DNA模板的反应液通过稀释分离成几千至几百万个反应单元，各反应单元独自进行PCR扩增，再直接计数有扩增产物的个数，可以检测出极微量的核酸模板量，理论上可检测出单个拷贝的模板量。

3．灵敏度高：

数字PCR灵敏度又称之为分辨率，指的是对目标基因或突变的识别能力。它除了与检测器的灵敏度、PCR扩增效率等因素有关外，很大程度上取决于反应单元的数目(n)。理论上每个反应单元至多有一个拷贝的DNA分子，当n＝103时，可实现1/1 000的最大分辨率，也就是说可被检出的样品浓度可低至0.1%。微流控芯片目前最大反应单元数可达百万级，因此，理论上低至0.000 1%的靶标样品浓度可被检出。

三、在医学检验领域的应用前景

由于数字PCR具有比传统qPCR更加出色的准确性、最低检测限和灵敏度，在基因检测方面具有广阔的应用前景[12,13,14]。

1．肿瘤早期诊断：

微流控芯片数字PCR可应用于癌症的等位基因突变[15,16]、拷贝数变异[17,18]、DNA甲基化[19,20]等方面检测，为肿瘤诊断提供新的工具。

等位基因突变可能会引发肿瘤，且突变基因与靶向用药、肿瘤药物疗效观察相关，但突变序列往往与大量正常序列同时存在，给检测带来困难。Zhang等[21]利用微流控芯片液滴数字PCR检测出0.1% EGFR基因突变，而同时使用的基于扩增耐突变系统qPCR只能检测到1%突变率。Watanabe等[22]利用微流控芯片液滴数字PCR检测治疗前非小细胞肺癌T790M突变率为79.9%，突变频率为0.009%至26.900%。

拷贝数变异研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异。微流控芯片数字PCR技术因其极高的扩增准确性和灵敏度，通过直接计数目标基因与参照基因的数目，计算比值，理论上可实现每10万个野生型序列中低至1个变异拷贝的检测。Pretto等[18]将22q11微缺失综合征纳入初生儿筛查，检测22q11缺失区域的拷贝数变异，最低可检测出1.5至3个碱基缺失。

DNA甲基化(或去甲基化)与很多疾病有关，如癌症、衰老、老年痴呆等。稀有甲基化检测检测方法如甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法等，一般难以检测到0.01%的突变位点。Wiencke等[19]同时采用微流控芯片数字PCR和甲基化特异性PCR检测外周血T细胞CD3Z基因去甲基化CpG启动区域，结果和流式细胞术进行对比，显示微流控芯片数字PCR结果与流式细胞术更为接近。

2．感染性疾病诊断：

现有病毒感染检测方法主要有qPCR法和免疫法等，需等病毒复制到一定的浓度或待相关抗体产生后才能检测到。微流控芯片数字PCR检测灵敏度高，理论上可检测出样本中单个拷贝模板分子，因此可检测出极微量的病原体，达到早期诊断感染性疾病的目的[23]。又由于微流控芯片数字PCR具有很强的灵敏度和准确性，无需进行细菌的培养、分离和纯化，即可检测出目的病原菌，适用于临床复杂样本的分析。Schell等[24]采用微流控芯片数字PCR系统直接检测出血中白念珠菌DNA，检测限可至5～10个菌。

3．产前诊断：

基于提高产前筛查准确性与降低产前诊断风险性的目的，从孕妇外周血取样直接分析胎儿的遗传信息的无创产前诊断掀起了研究热潮[25]。唐氏综合征的本质改变为体细胞内增加了一条额外的21号染色体。微流控芯片数字PCR将DNA分子分布到上万甚至上百万个独立的反应体系中，每个反应体系都含有指示21号染色体和1号染色体片段的探针，最后统计不同探针信号的比例，就可以获得21号染色体和1号染色体的相对数量信息，最低可检测到10%的三倍体基因，并可在数小时内给出结果，分析速度比常规1～2周时间大为提高。

四、展望

微流控芯片数字PCR技术因其独特的计算结果的方式、高灵敏度、高准确度等特性，特别适用于常规qPCR依赖Ct值不能很好分辨核酸检测，如拷贝数变异检测、稀有异常序列检测、单细胞基因表达分析和测序等。目前已有多家公司相关产品问世，如采用阵列微池式芯片的BioTrove公司OpenArray™系统和Life Technologies公司QuantStudio® 3D Digital PCR系统，采用集成微泵阀式芯片的Fluidigm公司Biomark系统，采用液滴技术的Bio-Rad公司QX100、QX200系统和RainDance Technologies公司的RainDrop™系统。这些技术和产品虽存在一些不足，如耗材昂贵且一般为一次性使用、操作较繁琐、反应单元的生成及转移过程中溶液的损耗所致灵敏度和准确性需进一步验证、检测线性范围较窄、样本通量低及生成及检测液滴耗时较长等问题，但已展示了该新兴产业未来巨大的应用潜力。

参考文献
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来源：中华检验医学杂志