Cas9基因敲除技术详述

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一、CRISPR系统的发现-从细菌的获得性免疫说起
CRISPR系统实际是细菌的一种获得性免疫系统。细菌被phage侵染之后，可以获得phage的DNA片段整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，从对phage形成免疫。
1） 早在1987年，日本人在大肠杆菌中发现有串联间隔重复序列。但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2） 随着测序技术和生物信息学的发展，2005年，三个研究组同时发现间隔序列（图中红色箭头所示）和侵染细菌的病毒或phage高度同源。从而推测，这一系统可能是类似于siRNA一样，是细菌抵抗Phage的一种机理。
（这些和植物的siRNA, 高等动物的获得性免疫一样，都是获取入侵病毒的一个片段形成记忆，从而再次遭到入侵时可以对抗入侵的一种方式）
这中间还有很多故事（mark先，待补充，还有adaptation的过程的发现），比如，
1） Phage上和CRISPR重复序列同源的序列突变后，Phage又可以重新可以侵染细菌。这显示在这一系统的工作过程中存在着一个序列配对机制。
2） 有些Cas蛋白突变后，细菌还可以获得入侵的DNA片段整合进基因组，但不能降解外源的DNA片段。这证明Cas系统中有的蛋白负责获取并整合外源DNA片段，而另一些酶负责在再次入侵时降解外源DNA。
3） 在Cas9功能不清楚时，其实就发现这个基因上的某些点突变可以导致整个系统不work。等Cas9的核酸酶的身份揭晓时，再回去看以前的数据，一切都豁然开朗了。这些突变恰恰就是Cas9核酸酶的活性位点。
二：谜团逐渐解开-从嗜热链球菌说起
2007年Science上又发表了一篇文章，作者是DANISCO公司的科学家，讲的是关于Streptococcus Thermophilus（嗜热链球菌），这个菌大家可能不熟悉，但他们的产品大家可能天天吃。这是工业上生产酸奶的菌种。工业生产中常遇到的问题就是这些乳酸菌会被Phage侵染，因此这些食品生产企业需要开发各种抗Phage的策略和分离抗phage的菌株，研究也发现抗Phage的菌株和敏感的菌株在CRIPSR的这些位点有差别，前面也讲到其他研究组发现CRISPR中间的重复序列和Phage的序列高度同源。于是，他们就想看一看通过增加和敲除CRISPR位点中间的重复序列是不是可以调节乳酸菌对Phage的敏感性。果然，实验结果正如他们所料。
随着研究的进一步深入，大家逐渐地意识到，细菌抵抗外界入侵的流程大致如上图所示，Cas位点编码多个核酸酶和解旋酶，他们把入侵的DNA切割，整合到CRISPR的重复序列中，形成记忆。当再次遭到入侵时，转录出RNA，Cas蛋白复合物利用这些和入侵的DNA同源的RNA去切割摧毁外源的DNA。
三：Type I and Type III CRISPR系统
随后对不同的菌的基因组测序及其他研究工作的积累，也使得CRIPSR的机理逐渐清晰。越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，随后研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。如图中的Type I and Type III. 这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。但其他几个系统的发现的过程也是非常值得一讲的，都是非常漂亮的工作。（mark先，待补充）

四：窗户纸就快捅破了-Cas9
很多同学知道Cas9, 并不知道还有Cas1,Cas2,Cas etc还有很多蛋白。
2012年突破终于来了，Jennifer A. Doudna（mark for 八卦，最年轻的女院士，女神 etc）和Emmanuelle Charpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA, 就可以完成识别和切割靶向的DNA。他们发现了
1） Type II CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA, tracrRNA)就可以切割双链DNA.
2） 同时，他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera RNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑性的DNA。
3） 同时他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：连个核酸酶活性分别切割靶DNA的两条链。
所有这些工作为现在的风生水起的CRISPR/Cas9的应用奠定了最根本的基础。到这里，大家都知道这个新的基因编辑系统即将呼之欲出了。

五：真核系统的应用
几乎同时，三个研究组发表三篇论文，两篇在《科学》杂志，一篇在《Elife》上报告了他们在哺乳动物细胞的应用。这就是拼人力、物力和效率来了（所以，可以跟科技部的领导说说，国内要发展绿色通道，开发自己的试剂，留住自己的人才，假设我们同时开始做这个课题，国外文章发了，我们还在等抗体）。核心思想早就在那里了，主要改进大家都一样，
1） 优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。
2） 加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。
3） 当然，同时需要表达一个guide RNA，把Cas9定位到靶DNA处。
用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。
六：进一步用Nickase增加编辑特异性
因为Cas9介导的靶向主要依赖于guide RNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。一系列的研究表明，这种方法的脱靶效应是广泛存在的。这很好理解，因为RNA-DNA的配对不是那么完美的。很快，MIT的张峰在Cell上发表了Double Nick的方法（当然同时也有很多人做，后面陆续也有不少组都有文章）。文章的原理很简单，其实早在2012那篇奠定基础的《科学》文章里就已经埋下了种子。Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用两对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点，这样就大大提高了靶向的特异性。


转自：http://blog.sina.com.cn/s/blog_12d8810790101ho5s.html

CRISPR/Cas9基因敲除阳性单克隆筛选：
可以采用有限稀释法筛选单克隆（如果您的敲除载体有puro等抗性，需要将电转后的细胞药杀后再有限稀释筛选单克隆），具体步骤如下：
1.将电转后pool细胞有限稀释至96孔板中，待3-4个星期后，单克隆细胞生长至足量，使用Genloci TNA抽提试剂盒提取基因组（针对微量样品，少到500个细胞的基因组提取）；
2.PCR敲除位点附近序列（可自行在靶位点前后合适位置设计检测引物）、Cruiser?基因敲除检测试剂盒筛选阳性克隆（错配酶酶切跑电泳方法）；
3.对第2步初筛的阳性克隆进行测序验证，对于两个等位基因不同敲除的克隆再进行TA克隆后测序验证，序列比对分析基因敲除情况。
最后筛出我们想要的单克隆。

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CRISPR/Cas9基因敲除突变检测——Cruiser基因敲除突变检测产品简介： 目前，市面上只有Genloci的Cruiser?、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法，被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而，SURVEYOR是进口产品，价格贵，货期长；T7EI可以识别多种DNA结构，如十字形DNA结构、Holliday结构等，故易出现假阳性；测序耗时长（1-3天），常常出现测序无信号等问题。13年初，Genloci通过植物基因工程表达产生高纯度的Cruiser?酶，它是一种具天然强活性的核酸内切酶，与CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链DNA的突变位点，并从突变位点的3’-端高效地切割异源双链DNA，不会出现假阳性。实验流程：1. 基因组DNA的准备：提取野生型和突变型细胞的基因组DNA（或者混合克隆的基因组）。Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒也能帮您的忙，只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA。2. 杂交DNA的准备：a) PCR引物设计：一般扩增产物长度为300~600 bpb) PCR扩增：获得杂交DNA3. Cruiser?酶筛选阳性克隆：无需纯化DNA，直接使用PCR产物，混合体系后45℃下反应15~20 min K562细胞中Atg10基因敲除案例M：100 bp-DNA Marker；pool：混合克隆；clone1-18：单克隆；positive：Positive Control DNA结论：pool（混合克隆）的结果显示，基因敲除的效率约为40%。clone3, 7, 8, 11, 15和17为潜在的阳性克隆，后续直接进行TA克隆进行验证等位基因突变情况。

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基因敲除、阳性单克隆筛选、真核细胞、斑马鱼、 基因组、植物  
CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic  Repeats）RNA，是最近几年才发现

的原核生物中的调控 RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。在 II 型 CRISPR 系统中，CRISPR  RNA（crRNA

）与转录激活 crRNA（Trans-activating crRNA,  tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列

，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA  双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。CRISPR-

Cas  系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、

植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶

（Transcription  activator-like effector nucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas  系统介导的基

因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
Genloci 专注于基因编辑多年，最新推出基因组编辑工具  CRISPR/Cas9 专家系统，该系统灵活简单、

可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9  系统可广泛应用于基因组

工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9 体系为基因组工程研究提供了一

项简便而强大的工具。
作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9 有以下特点和优势：  
1、操作简单，靶向精确性更高。
2、CRISPR/Cas9 系统是由 RNA 调控的对 DNA  的修饰，其基因修饰可遗传。
3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等
4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
5、无物种限制。
6、实验周期短，最快仅需  1 个月，节省大量时间和成本。
CRISPR/Cas9 的应用中，活性检测或是突变效率的检测：  
   错配酶法靶序列经 Cas/sgRNA  切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或

多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列 PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶将识别错

配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出  Cas/sgRNA 的活

性。

nyizq

我也来看了，很不错，收藏了