上海巴斯德研究所龙钢课题组HCV重大进展

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丙型肝炎病毒（HCV）是一种特异的高度依赖宿主脂蛋白和脂类的病毒，病毒粒子在组装过程中与细胞低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白紧密结合形成脂病毒样颗粒（LVPs），后者是HCV主要的存在形式和感染性颗粒。近日，来自中科院上海巴斯德研究所的龙钢研究员课题组首次发现了细胞外脂蛋白中载脂蛋白apoE能够影响HCV的感染，胞外脂蛋白的apoE可以与LVPs上的apoE进行交换，LVPs中高浓度的apoE水平有助于病毒吸附到细胞表面，相关研究成果发表在国际期刊《病毒学杂志》（Journal of Virology）上。

据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV，其中约80%的HCV感染者发展为慢性丙型肝炎，部分病人将发展成肝硬化甚至肝癌。目前直接抗病毒活性（DAA）药物，在无需采用干扰素就能安全有效治疗慢性丙肝，给广大病人带来了福音。然而随着病毒耐药性的产生，新抗病毒策略的提出就显得愈发迫切。

龙钢研究员博士后师从德国海德堡大学的HCV大牛Ralf Bartenschlager，后者因为对解析HCV如何在肝脏细胞中进行复制做出杰出贡献而成为今年拉斯克临床医学奖获得者之一。龙钢研究员于2013年回国出任上海巴斯德研究所病毒组装与宿主研究课题组组长，课题组致力于研究HCV病毒感染过程的入侵细节，组装过程和宿主相互作用等。希望通过这些研究揭示病毒组装和释放过程中的关键事件，加深人们对HCV入侵和组装的认知，并期望以此为靶标开发干扰病毒组装和传播的新药物。

脂蛋白（lipoprotein），是指脂质与载脂蛋白（apolipoprotein）结合在一起形成的脂质-蛋白质复合物，脂蛋白的合成和分泌主要在肝脏和肠内进行。脂蛋白中脂质与载脂蛋白之间没有共价键结合，多数以疏水性相互作用而结合在一起。血浆中脂蛋白分为高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）及乳糜微粒（CM）。脂蛋白在动物体内脂质的运输和代谢等方面起非常重要作用，异常可导致心血管疾病。HCV组装时和宿主极低密度脂蛋白VLDL 合成通路紧密相关，形成具有感染性的LVPs。LVPs表面有多种载脂蛋白包括不可交换的apoB和可交换的apoE，apoA和apoC。apoE是低密度脂蛋白受体（LDLR）的配体，因此参与了HCV病毒粒子的入侵，但人们对apoE 如何精细调控病毒入侵等分子机制还存在很多疑问。

在本研究中，研究人员对细胞外脂蛋白与LVPs中的apoE是否存在交换及是否影响HCV感染进行了深入研究。通过构建apoE稳转下调、稳转回复表达Huh7.5.1细胞，研究人员发现不管HCV来源于哪种细胞，感染apoE稳转下调细胞的效率要明显低于正常细胞和稳转回复表达细胞，而所有的这些细胞表达的HCV受体和LDLR并没有差别。通过培养基互换和apoE抗体处理，发现正是这些apoE表达水平不同的细胞分泌到培养基中的apoE量影响了HCV感染细胞的效率。

研究人员推测培养基中的脂蛋白的apoE能够与VLPs上apoE进行交换，而实现apoE在VLPs与培液中的浓度平衡。为了验证这一推测，研究人员从正反两个方面进行验证。一方面，将稳转表达apoE-HA的细胞上清与正常HCV孵育，然后用HA抗体进行亲和分离，发现HA抗体分离的组分中除了apoE外也能检测到病毒蛋白Core和E2；另一方面，研究人员对HCV的E2蛋白进行Flag标签标记，然后分别与apoE稳转下调、稳转回复表达Huh7.5.1细胞上清进行孵育，经Flag抗体亲和分离后在检测到E2蛋白同时能够检测到apoE。研究人员最后在病毒吸附实验中发现，LVPs中的高水平apoE能够存进病毒的吸附，从而有益于病毒感染。

该研究首次揭示了在HCV感染过程中，细胞外apoE可以在脂蛋白和LVPs之间进行交换，调节培液与LVPs上apoE的浓度平衡，可以影响HCV感染效率，丰富了人们对HCV脂质不均一性的理解。该研究由上海大学与巴斯德所联培硕士生杨再立等在龙钢研究员指导下完成，研究得到巴斯德所钟劲研究员和吉林大学第一医院牛俊奇副院长的帮助，得到国家科技部和中科院项目资助。

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dianhh012786

恭喜龙师兄

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Neglected but Important Role of Apolipoprotein E Exchange in Hepatitis C Virus Infection

Zaili Yang, Xiaoning Wang, Xiumei Chi, Fanfan Zhao, Jinxu Guo, Pengjuan Ma, Jin Zhong, Junqi Niu, Xiaoyu Pan and Gang Long

ABSTRACT
Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease, infecting approximately 170 million people worldwide. HCV assembly is tightly associated with the lipoprotein pathway. Exchangeable apolipoprotein E (apoE) is incorporated on infectious HCV virions and is important for infectious HCV virion morphogenesis and entry. Moreover, the virion apoE level is positively correlated with its ability to escape E2 antibody neutralization. However, the role of apoE exchange in the HCV life cycle is unclear. In this study, the relationship between apoE expression and cell permissiveness to HCV infection was assessed by infecting apoE knockdown and derived apoE rescue cell lines with HCV. Exchange of apoE between lipoproteins and HCV lipoviral particles (LVPs) was evaluated by immunoprecipitation, infectivity testing, and viral genome quantification. Cell and heparin column binding assays were applied to determine the attachment efficiency of LVPs with different levels of incorporated apoE. The results showed that cell permissiveness for HCV infection was determined by exogenous apoE-associated lipoproteins. Furthermore, apoE exchange did occur between HCV LVPs and lipoproteins, which was important to maintain a high apoE level on LVPs. Lipid-free apoE was capable of enhancing HCV infectivity for apoE knockdown cells but not apoE rescue cells. A higher apoE level on LVPs conferred more efficient LVP attachment to both the cell surface and heparin beads. This study revealed that exogenous apoE-incorporating lipoproteins from uninfected hepatocytes safeguarded the apoE level of LVPs for more efficient attachment during HCV infection.

IMPORTANCE
In this study, a neglected but important role of apoE exchange in HCV LVP infectivity after virus assembly and release was identified. The data indicated that apoE expression level in uninfected cells is important for high permissiveness to HCV infection. Secreted apoE-associated lipoprotein specifically enhances infection of HCV LVPs. apoE exchange between HCV LVP and lipoproteins is important to maintain an adequate apoE level on LVPs for their efficient attachment to cell surface. These data defined for the first time an extracellular role of exchangeable apoE in HCV infection and suggested that exchangeable apolipoproteins reach a natural equilibrium between HCV LVPs and lipoprotein particles, which provides a new perspective to the understanding of the heterogeneity of HCV LVPs in composition.

http://jvi.asm.org/content/90/21/9632.abstract

blackrose

让人振奋的成果！