深部真菌的耐药性及其耐药机制研究

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作者：赵虎
单位：复旦大学附属华东医院检验科

随着侵入性诊疗手段的广泛使用以及激素和抗菌药物的大量应用, 临床深部真菌感染越来越多见, 侵袭性真菌感染（invasive fungal infection, IFI）已成为临床常见的感染性疾病之一, 尤其高发于免疫功能低下的人群, 包括获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）、器官或骨髓移植、恶性肿瘤等患者, 病死率也越来越高[1], 已引起临床的高度重视。

临床常见的致病性或条件致病性真菌主要包括以下几类：（1）念珠菌, 主要为白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌和光滑念珠菌; （2）曲霉, 主要有烟曲霉和黄曲霉; （3）隐球菌, 主要为新生隐球菌及其变种; （4）毛霉菌, 以总状毛霉多见; （5）组织胞浆菌, 主要为荚膜组织胞浆菌[1]。

随着抗真菌药物的大量应用, 真菌对抗真菌药物的耐药性也逐渐增强, 这降低了临床抗真菌治疗的效果, 增加了临床抗真菌治疗的难度[1, 2]。本专题共征集了4篇论著和1篇综述, 阐述了白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的耐药性及其耐药机制, 旨在为临床抗真菌治疗提供参考依据。

一、念珠菌的耐药性及其耐药机制

念珠菌是临床最常见的条件致病性真菌, 其中白念珠菌是念珠菌属中最多见的条件致病性真菌, 了解其耐药性及其耐药机制, 有助于临床抗真菌感染的治疗。

唑类药物是治疗深部真菌感染的主要药物, 也是治疗白念珠菌感染的首选药物。根据化学结构的不同, 唑类药物被分为咪唑类和三唑类, 目前临床上应用最多的是三唑类抗真菌药物, 包括第1代的氟康唑、伊曲康唑和第2代的泊沙康唑、伏立康唑、雷夫康唑等。唑类药物的作用机制是竞争性抑制真菌羊毛甾醇14α 去甲基化酶, 干扰真菌细胞膜脂质合成, 从而导致真菌死亡[1, 2]。

随着第1代唑类抗真菌药物的大量应用, 白念珠菌对氟康唑和伊曲康唑的耐药性逐年增强, 对第2代唑类抗真菌药物也出现一定的耐药性, 故检测与分析念珠菌对唑类药物的耐药性并研究其耐药机制具有重要的临床意义。

复旦大学附属妇产科医院吴永琴和应春妹撰写的综述“ 白念珠菌唑类药物相关耐药基因及其调控机制的研究进展” , 系统阐述了白念珠菌对唑类药物的耐药机制。（1）外排机制：真菌外排泵的外排机制导致细胞内药物积累减少, 从而降低了细胞内药物浓度, 使真菌对唑类药物产生耐药[3, 4, 5]; （2）药物作用靶酶的改变：唑类药物的靶酶为ERG11基因编码的羊毛甾醇14α 去甲基化酶, ERG11基因突变导致羊毛甾醇14α 去甲基化酶氨基酸序列变异, 使羊毛甾醇14α 去甲基化酶与氟康唑和伊曲康唑的亲和力下降, 致使真菌获得了耐药性[6, 7]; （3）生物膜相关耐药基因及其调控：白念珠菌生物膜耐药机制复杂, 目前相关耐药基因也陆续被发现。NOBILE等[8]最早证实菌丝壁蛋白1（hyphal wall protein 1, Hwp1）是白念珠菌体内生物膜形成所必需的物质, Hwp1/Hwp1突变株较Hwp1/Hwp1重组株生物膜形成能力显著下降, 而且Hwp1基因的表达受到锌簇转录因子Bcr1的调控。白念珠菌生物膜形成过程中调控机制复杂, 有研究表明转录因子Bcr1可以对多种菌丝壁蛋白进行调控[9]。该文总结发现, 白念珠菌对唑类药物的耐药问题已经成为临床抗白念珠菌治疗的棘手问题, 而白念珠菌对唑类药物的耐药机制复杂, 耐药基因较多, 临床分离的耐药菌株往往具有多种耐药基因, 耐药基因的调控在白念珠菌耐药机制中发挥主要作用。

上海交通大学医学院附属瑞金医院的王影和项明洁等撰写的“ 白念珠菌MRR2基因错义突变C1409A与氟康唑耐药的相关性” 一文, 研究锌簇转录因子— — 多药耐药调节因子2（multidrug resistance regulator 2, Mrr2）编码基因MRR2错义突变C1409A与白念珠菌对氟康唑耐药的相关性。作者利用白念珠菌工程菌SN152构建MRR2基因敲除菌株, 通过一步法克隆及定点突变技术构建MRR2基因C1409A突变型表达质粒, 再用高效醋酸锂转染法将质粒片段转染入MRR2基因敲除菌株, 异位表达于ADE2位点以构建MRR2基因定点突变菌株。通过体外药物敏感性试验及实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）分析错义突变C1409A与白念珠菌对氟康唑耐药的关系。研究发现, 与工程菌株SN152相比, 氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变的白念珠菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）增加4倍, CDR1表达上调约3倍。该研究结果提示MRR2基因错义突变C1409A可上调白念珠菌CDR1表达并介导白念珠菌对氟康唑的耐药, 揭示了白念珠菌的一个耐药机制, 具有重要的临床价值。

同济大学医学院的王东江和同济大学附属东方医院南院的吴文娟撰写的“ 外阴阴道念珠菌病病原谱及抗真菌药物敏感性特征” 一文, 研究上海市嘉定区妇女外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis, VVC）患者的年龄、菌群分布以及病原真菌对体外抗真菌药物的敏感性, 为VVC临床诊疗提供依据。该文采集2015年7至10月上海市嘉定区妇幼保健院VVC患者阴道后穹隆分泌物样本, 采用科玛嘉念珠菌显色培养基结合ATB微生物鉴定系统进行培养和初步鉴定, 所有菌株均采用真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）1、ITS4测序鉴定。用Sensititre Yeast One真菌药物敏感性鉴定系统进行药物敏感性试验, 测定MIC, 依据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）M27-S4标准判读MIC结果。该文共分离出829株念珠菌, 复发组82株。发病年龄以成年妇女（20~59岁）为主（占97.1%）。在分离的菌株中, 白念珠菌占77.1%（639/829）, 光滑念珠菌占15.1%（125/829）, 近平滑念珠菌占3.4%（28/829）, 热带念珠菌占2.1% （17/829）, 克柔念珠菌占1.6%（13/829）, 酿酒酵母占0.8%（7/829）。分离的菌株对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净的敏感率分别是51.8%、65.2%、34.0%、95.7%、100.0%、100.0%、100.0%。该文结果提示白念珠菌是VVC的主要病原菌, 对唑类药物耐药率较高。VVC患者应当根据药物敏感性试验结果合理选择抗真菌药物, 进行精准治疗, 以减少耐药菌株的产生。

二、曲霉的耐药性及其耐药机制

由曲霉引起的侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis, IA）是造血干细胞移植患者及免疫抑制患者常见的机会性感染[10]。临床上最常见的致病性曲霉为烟曲霉。

唑类药物是IA的主要治疗药物, 目前临床上用于治疗IA的药物首选伏立康唑, 伊曲康唑可用于补救治疗, 泊沙康唑为IA的预防性药物[10]。近年来, 随着唑类药物的广泛应用, 曲霉对其的耐药性也不断增强[11]。

曲霉对唑类药物耐药的机制与念珠菌相似, 也是以cyp51A基因发生突变, 导致L98H氨基酸发生改变, 引起CYP51结构变化, 从而导致耐药的产生[12]。曲霉的耐药机制还包括外排泵机制[5]和作用靶点的改变[6]。

北京大学真菌和真菌病研究中心王千和李若瑜等撰写的“ 临床分离的携带TR34/L98H型的耐唑类药物烟曲霉的耐药机制分析” 一文, 对临床分离的耐唑类药物烟曲霉菌株进行耐药机制研究。该研究选择从IA患者的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中分离的1株烟曲霉, 采用CLSI M38-A2微量液基稀释法测定伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净对该菌株的MIC/最低有效浓度（minimal effective concentration, MEC）, 并对该菌株的唑类药物靶酶基因cyp51A进行克隆和序列测定分析, 扩增并检测该菌株的9个微卫星标记位点, 将其与具有相同耐药基因型的国际上已经报告的烟曲霉菌株进行UPGMA聚类分析。研究发现伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B对该菌株的MIC分别为> 16、2、0.5和2 μ g/mL, 卡泊芬净对该菌株的MEC为0.25 μ g/mL; 该菌株的cyp51A基因序列中存在启动子区-288~-322位间34 bp串联序列的插入, 其编码区T364A、T960A及T1554A碱基的点突变分别导致所编码蛋白98位、297位及495位氨基酸的置换（TR34/L98H/S297T/F495I）; 微卫星分析显示该菌株的微卫星分型与先前国际上欧洲国家、亚洲其他国家分离的TR34/L98H/S297T/F495I菌株不同。该研究从1例IA患者BALF中分离到的对唑类药物耐药的烟曲霉临床菌株, 其耐药性是由cyp51A基因启动子区34 bp的串联序列插入结合基因编码区突变所致98位、297位及495位氨基酸置换（TR34/L98H/S297T/F495I）所介导, 研究发现该菌株是中国所特有的、不同于国际上已描述的对唑类药物耐药的病原性烟曲霉。

三、新生隐球菌的耐药性及其耐药机制

新生隐球菌是临床常见的致病性真菌之一, 可引起隐球菌性肺炎和脑膜炎等多部位的真菌感染, 也是真菌性脑膜炎最常见的致病菌, 尤其易导致免疫抑制的宿主感染, 特别是AIDS患者的感染。近年来, 随着AIDS、肿瘤化疗、器官移植等患者的增多, 隐球菌病的发病率呈上升趋势[13]。两性霉素B是隐球菌性脑膜炎的首选抗真菌药物[14], 氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑在体外对新生隐球菌的抑菌效果较好[14, 15], 但近年来也出现了耐药现象, 所以建议治疗前进行体外药物敏感性试验进行判断, 而且要考虑在脑脊液中的药物浓度。

复旦大学附属华山医院朱均昊和章强强等撰写的“ 华东地区新生隐球菌药物敏感性分析” 一文, 探索近年来华东地区分离的新生隐球菌临床株对常用抗真菌药物的体外敏感性。该研究采用CLSI推荐的M27-A3肉汤微量稀释法检测氟康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑对新生隐球菌临床分离株的MIC范围, 并通过ITS测序法对检测出的耐药和剂量依赖性敏感（susceptible-dose dependent, SDD）的菌株进行进一步鉴定。研究发现, 抗真菌药物对96株新生隐球菌的MIC90（MIC范围）为：氟康唑 4（0.5~16）μ g/mL, 氟胞嘧啶 4（0.25~64）μ g/mL, 两性霉素B 0.5（0.03~1）μ g/mL, 伊曲康唑 0.5（0.03~1）μ g/mL, 伏立康唑 0.25（0.03~0.5）μ g/mL, 所有耐药菌株及SDD菌株的分子鉴定均为新生隐球菌格鲁比变种。研究表明, 除伊曲康唑外, 华东地区新生隐球菌临床株对抗真菌药物的敏感性高, 耐药菌株少, 不敏感株以新生隐球菌格鲁比变种为主。

四、总结与展望

深部真菌感染越来越多见, 尤其在包括AIDS、器官或骨髓移植患者在内的免疫功能低下人群中高发, 已严重威胁患者的生命安全, 应引起临床的高度重视。抗真菌药物是控制深部真菌感染的关键, 而目前深部真菌对抗真菌药物产生的耐药性已严重影响了临床抗真菌的药物治疗效果。所以, 了解深部真菌的耐药性并研究其耐药机制, 提供新抗真菌药物的作用靶点, 有助于新抗真菌药物的研发, 同时也为临床合理选用有效的抗真菌药物进行抗真菌治疗, 迅速控制真菌感染, 并减少真菌耐药性的产生提供参考依据, 这有着重要的临床意义。
本专题的4篇论著, 从不同角度分别研究了白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的耐药性及其耐药机制, 具有一定的科学性、先进性和实用性, 可为临床抗真菌治疗和新抗真菌药物的研发提供较好的试验依据。

深部真菌耐药性和耐药机制研究的不断深入, 可以更加全面地揭示真菌的耐药机制, 有利于研发出更加高效的抗真菌药物, 从而更加迅速、有效地控制真菌感染, 为IFI患者带来福音。

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