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发表于 2015-1-31 20:04:10
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九、后续工作" c9 p* |7 I( w$ ?3 ]7 \
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克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。* w9 _: D# k; g: y- E6 E. i
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(一) 克隆化方案
+ W( l5 P: w% e/ A Z& z. H 用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1 M8 Z4 }/ H( F+ H 1. 有限稀释法的程序
) ^& ?, \) c6 @8 T ① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)3 n# b7 s2 t. U- x: @! S
② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml( i# W- l3 w% j( k* R. t' `- {
③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。
$ u$ N3 j5 W" p7 Z# S4 W ④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。( {; @; m' m T7 t! `
⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。7 U& n+ K. U; ]
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
+ X) ?. Z) o4 a" V 2. 软琼脂法
. o$ ^! k! A7 P9 a ① 软琼脂的配制
1 M. x+ l Y. g, T 含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640" ]1 j4 T% g* T7 J1 \" z( e
1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。* I" g& n3 w# I2 J/ g
0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
5 b% E5 I; R* a" v. B) O: Q ② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。2 c% K: p* C+ X* u6 O! E
③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。; M* i/ d6 a* q3 \3 `3 s* v, h; k
④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。+ H) g0 f0 f( ?, o; a- @; P
⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。
4 Z$ G) H$ L: W- e; C ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
6 h J1 K( d) G, q$ F# E( V ⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。. T( ]% N! f4 J. R, |
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(二) 杂交瘤细胞的冻存
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及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。- d) B3 G4 e0 E% R: q
& U1 R# M- N1 |% {) R$ A% ~ 杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一管。$ U- [* K5 ~9 p. m$ l+ H( g
细胞冻存液:
8 w$ V) k# q# k# \ 50%小牛血清
) K* }$ ^3 `* d; p" U 40%不完全培养液
6 n O' g: \0 ~, U# Z5 c$ }; z 10% DMSO(二甲亚砜) f% d" T) ^7 F) A* o$ y0 s/ |: P- a
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 |
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