细胞技术统计交流

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从事一些细胞培养技术方面总结统计工作，对细胞查询国内库有些了解，查询细胞，及培养特性一直做些总结，还要向各位老师学习交流。

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案例及经验交流（悬浮细胞注意事项）-NK92
悬浮细胞或NK92细胞阶段总结经验及建议，不对处望老师指正，以下是悬浮细胞用冻存液注意事项(通过对NK92细胞及相关悬浮细胞销售，售后，技术交流，统计等服务工作，建议对悬浮细胞冻存挑剔提出几点建议供参考：
冻存液配置：建议头天配好后-4度保存，第二天用。
冻存步骤建议：两指厚棉包裹后，直接-80保存一天后，第二天液氮。
复苏步骤，因悬浮细胞常出现此类问题，上述两项注意后，复苏如果不理想，可放培养箱2-4周，不用管他，大部分情况细胞可复苏过来，一般细胞透亮，复苏成功率更高。很多案例说明，这类细胞能从很少几个细胞培养到理想状态，欢迎各位老师交流培养过程中问题解决方案及经验。
冻存液配置建议：90%血清里加百分之十的DMSO，然后加200单位没毫升的IL2。（该细胞生长依赖特点，适合NK92细胞）
如团聚厉害，后期影响细胞状态，建议离心后用胰酶消化下，总只细胞吹打等方法都可以，尽量把细胞消化成单个的细胞。后期实验会顺利些。建议用0.05胰酶消化时间可稍长，虽然胰酶浓度低，可稍长时间消化，会使细胞尽量消化成单个细胞。（另因很长时间生长的难消化细胞，我们意见是，培养条件不适合，生长缓慢。不适合此方法，建议筛选适合的培养条件）

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细胞培养-成团成片统计交流
目前统计问题成团成片常见细胞：后续解决方案稍后总结好后发您共享，希望各位老师参与我们统计活动。
比较常见细胞：
绒癌细胞JAR  结肠癌LOVO细  293细胞  肝星状细胞  原代神经神经干细胞  A7R5平滑肌细胞  MCF7细胞 PC12 PK15和ST  成骨细胞  NRK细胞,calu-3，T-47D  HCT-8 胰腺癌BXPC-3 成纤维细胞  sw480 Vero HepG2 海马神经元原代培养细胞、成团生长的癌细胞如何消化成单细胞上流式   SH-SY5Y细胞 HCT－116  C2C12肺癌的原代 原代乳腺癌细胞 原代乳鼠大脑皮层神经细胞  白血病细胞系UKE1  u87细胞生长成团  SK-OV-3细胞 4T1细胞离心后细胞成团怎么办  HepG2.2.15细胞成团生长 YAC-1成团现象严重！！ HL-60细胞培养的成团现象?  LS 174T 细胞一直聚团，不容易消化 大鼠肺成纤维细胞 PC9细胞 HCT细胞 MSC

统计建议方案：
一：低浓度胰酶稍长时间消化，贴壁与悬浮可回信
二：胰酶前一步，etda直接消化。
三：DNAsa裂解。

后两种方法有效果的老师，建议留下详细操作步骤。
试剂引起的细胞状态老化，请区别下。还有较好的血清也会引起细胞成团（有些血液类）要与试剂引起的老化要区分。上述建议沟通前，列出细胞来源，详细培养方法。细胞状态描述。

有更好方法的老师可回信告知，说的不对处，请老师指正。

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细胞培养应用一 禽腺病毒全病毒及基因工程疫苗技术
目前，绝大部分疫苗厂家都已采用 LMH 细胞生产禽腺病毒疫苗，但由于 LMH 细胞的 易聚团、难贴壁等特性，因此，在疫苗产业化过程中大规模培养 LMH 细胞有一定困难， 而且病毒滴度低，基本都在 107.0/0.1ml 左右，极大地限制了产能。本公司经过多年研究 建立了一种新型 LMH 细胞的培养方法，利用特殊的集全新细胞贴壁与病毒增殖于一体的 独特技术，使 LMH 细胞贴壁时间大为缩短，而且细胞培养 192h 后仍保持较好细胞形态， 易于禽腺病毒病毒的复制与增殖及后续毒价测定。4 型禽腺病毒病毒 TCID50 效价大于 108.5/0.1ml，目前 1ml 全病毒培养液可配制 200 羽份疫苗，可 100%保护 SPF 鸡免受 4 型禽腺病毒强毒的攻击（未免疫组攻毒 72h 后 100%死亡）。该试验结果由不同厂家不同 专业人员多次在细胞工厂上验证完成
该技术关键技术是贴壁试剂的应用，目前该株细胞已传70代，细胞无任何影响。

科研用户贴壁试剂应用细胞有：LNCAP  A172  

近期实验293慢病毒腺病毒转染技术储备案例充足，转化预期快。

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血液类细胞:这类细胞筛选血清较准确-目前正在统计转染
   
    THP-1,HL-6 RAW 264.7  J774A.1  K562  MOLT-4 Jurkat  Daudi  RAJI  U937 NK92  YT  YTS
    我司准备对血液类细胞对国外来源身份明确的细胞准备保种，目前我们熟悉并处理的有THP-1,HL-60等几株协和来源细胞与用户做了成熟培养体系的试剂评测统计后推荐，目前对OCI -Ontario Cancer Institute 安大略癌症研究所机构来源的OCI-Ly1, OCI-Ly2, OCI-Ly3, OCI-LY4, OCI-Ly7, OCI-Ly8, OCI-Ly12, OCI-Ly13.2, OCI-Ly17, and OCI-Ly18, by G-banding, SKY, and CGH,这几株细胞有兴趣保种，如有STR数据，有必要，我们在国内可做STR进行细胞鉴定。提供细胞的实验室，可免费享用我们库的该类细胞。保种优势是，血清培养基耗材等试剂都要原装进口。加上多年的培养经验。已用过国产试剂耗材的细胞暂时不考虑。
   发信的目的是，统计后很多实验室试剂培养体系不太适合血液类悬浮细胞培养，包括冻村步骤与复苏步骤。（附件是我们统计总结后的一些小经验）其他细胞基础经验交流可来信标明.
去除外泌体血清说明书有需要可来信说明
   相关其他经验交流统计：好血清促使细胞团聚，该类细胞有这些特性，我们目前解决办法是，离心后低浓度胰酶消化下解决团聚。
血清试用可发我们实验室名称，采购负责老师姓名电话后，可发试用装（20ML)
----------------悬浮细胞培养注意事项
售后案例及经验交流（悬浮细胞注意事项）-NK92、THP-1血液类
悬浮细胞或NK92、thp-1细胞阶段总结经验及建议，不对处望老师指正，以下是悬浮细胞用冻存液注意事项(通过对NK92细胞及相关悬浮细胞销售，售后，技术交流，统计等服务工作，建议对悬浮细胞冻存挑剔提出几点建议供参考：
冻存液配置：建议头天配好后-4度保存，第二天用。
冻存步骤建议：两指厚棉包裹后，直接-80保存一天后，第二天液氮。
复苏步骤，因悬浮细胞常出现此类问题，上述两项注意后，复苏如果不理想，可放培养箱2-4周，不用管他，大部分情况细胞可复苏过来，一般细胞透亮，复苏成功率更高。很多案例说明，这类细胞能从很少几个细胞培养到理想状态，欢迎各位老师交流培养过程中问题解决方案及经验。
冻存液配置建议：90%血清里加百分之十的DMSO，然后加200单位没毫升的IL2。（该细胞生长依赖特点，适合NK92细胞）
如团聚厉害，后期影响细胞状态，建议离心后用胰酶消化下，总只细胞吹打等方法都可以，尽量把细胞消化成单个的细胞。后期实验会顺利些。建议用0.05(或浓度更低）胰酶消化时间可稍长，虽然胰酶浓度低，可稍长时间消化，会使细胞尽量消化成单个细胞。（另因很长时间生长的难消化细胞，我们意见是，培养条件不适合，生长缓慢。不适合此方法，建议筛选适合的培养条件）

成团问题希望今后与各位老师一起统计学习。
消化后成片问题正在统计中，希望与老师们一起找到理想的解决方案。
-------------------转染
悬浮细胞转染目的（电转及转染），细节分析统计（我司对细胞较了解，有交流的老师可沟通）

一：转染细胞贴壁时间，新铺板的细胞跟容易转染进去，细胞未贴壁。思考：转染物质轻重，如果在底层，细胞贴壁过程促进转染？

二：1640钙物质是否有影响，无钙1640或opti-mem

三：玻璃瓶对转染实验影响相对小。

四：操作步骤，建议能旋转培养瓶，让转染物质有条件进入细胞。（超声震动也准备上实验试试）

五：能否用我们贴壁试剂，将细胞贴壁后做转染。（有兴趣用该方法的老师可来信注明）

六：免疫细胞（大部分免疫细胞是悬浮细胞）是否有对外来物质有免疫保护，细胞膜研究能否给些建议。或技术老师的经验办法方案能否配合解决

七：低温对转染物质的影响（超声震动也准备上实验试试）

  八：通过对几个工业用户咨询，建议质粒要用凯杰大提或维格拉丝大提，其他牌子的不建议用，后续影响实验。
---质粒

九：质粒提取，要用无内毒素质粒抽提试剂盒

十：慢病毒质粒的目的基因大小建议小于4kb，大的成功率很低

十一：建议在质粒中加入荧光报告基因和真核抗性筛选标记，便于筛选阳性克隆和检测转染效率

十二：传代的离心步骤加入聚乙烯亚胺转染试剂(Polyethylenimine）或脂质体与转染载体，离心后直接培养

十三：NK细胞，DC细胞 大厂家培养基长期统计评测，及含血清方案统计 life:AIM V培养基、LONZA:VIVO-15
细工生物技术交流（来信标注悬浮转染）

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乳腺癌类细胞国内大概情况

https://www.keyword-suggest-tool ... c+human+cell+lines/
国内已有细胞已上手培养统计总结问题交流 培养技术细节有些经验 前提是进口试剂耗材（列出试剂耗材厂家货号目的是统计总结才有意义）
MCF-10A        MDA-MB-453        BT-549        MDA-MB-468        Hs578T        MDA-MB-157        HCC-1428        SW527        SUM-52PE        HCC-1937        MDA-MB-231        MCF-7        CAMA-1        BT-474        SUM190PT        SK-BR-3        ZR-75-1        ZR-75-30        T-47D



未上手准备统计总结培养要点
准备寻找正规库来源或实验室进口试剂耗材国外来源 有培养经验的老师能否留下培养细节关键点 建议进口试剂耗材可沟通
DU4475        HCC-38        CAL-851        HCC1-806        SUM159        SUM149        MCF-12A        HCC-1187        HCC-1569        CAL-120        HCC-1143        CAL-148        HCC-3153        MDA-MB-134-V        HCC-70        SUM1315M02        CAL-51        EL-12-58        SUM185PE        MDA-MB-436        HCC-1395  
MEM223  -ecacc-98050130


欢迎国外实验室参与：细胞培养技术交流、研究方向统计交流、细胞经验交流（上述国内培养有些经验，欢迎常年深入交流，需实验合作实验室可PM我）

要点
消化步骤：在倒置显微镜下观察细胞，直到细胞层分散（通常在5至15分钟内）注意：为避免结块，在等待细胞分离时，不要通过敲击或摇晃烧瓶来搅动细胞。难以分离的细胞可放置在37°C以便于分散
新的培养血管中加入适量的细胞悬液
冷冻培养基：完全生长培养基，95%；二甲基亚砜，5%

以上试剂耗材都要原装进口

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293细胞慢病毒包装新预期结果准备做下（后面实验结果做完在公布） 有病毒低度要求高的老师 可来信交流

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细胞培养相关参考-铜-in-out

William's E media is supplemented with 0.4 µM  copper
Ham's F-10 or F-12 media for low serum and serum-free applications. The original Ham's F-10 and F-12 media were supplemented with 10 µM copper.
DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12  contains 0.0052 µM  copper
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 常被用作开发无血清杂交瘤培养基的基础配方中不含铜。然而，这些培养基经常补充白蛋白。白蛋白是铜的一种生理转运分子，纯化的天然白蛋白可能含有足够的铜，至少部分地支持培养中的细胞。-杂交瘤


氯化铜 二水合物 powder, BioReagent, suitable for cell culture
C3279-100G  100 g   424.94
C3279-500G  500 g 1,513.94
硫酸铜 五水合物 Copper(II) sulfate pentahydrate  BioReagent, suitable for cell culture, ≥98%
C8027-500G  ToolTipBottom 500 g 919.40

相关研究
在动物细胞体外培养阶段，铜离子是不可或缺的添加剂成份，在培养液中的浓度影响着细胞的生长和代谢。铜离子在细胞内以辅基的形式参与许多重要的代谢途径，作为酶的辅助因子驱动细胞呼吸、神经递质的传递、铁离子的摄取和抵抗氧化应激等重要的生理过程。

有研究表明，铜进入机体主要是以酶的辅助因子形式参与氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成、儿茶酚胺代谢、结缔组织交联、血液凝固和毛发形成等代谢过程。含铜酶的活性是受铜离子调控的，添加铜可提高细胞内CuZn-SOD的活性。CuZn-SOD

能消除自由基对机体的毒害作用，从而改善机体代谢的内环境，促进机体生长发育。

在细胞内铜离子浓度过低时，会影响相关酶的活性及相应的生理代谢途径，进而影响细胞的正常生长 ；相应的细胞内铜离子浓度超过细胞的生理需求时，促进形成自由基，同时能氧化蛋白，脂类和 DNA，造成细胞膜电位的下降进而引起细胞的死亡。

牛血清中含有较高浓度的铜离子，在细胞基础培养基中加10% 牛血清时铜离子可浓度达到50～120ng/ml，其处于细胞可接受的生理范围内，因此不需要额外补铜。如使用无血清培养基，则应注意培养基中的铜离子浓度。

铜内胆的细胞培养箱
美国EPA(环保署)等多家世界权威机构的科学证明，抑菌铜在两小时内杀死超过99.9%的细菌，成为全球最有效的接触面材料。具有抗菌性能的表面材料，能有效地控制医院中各类抗药性细菌的生长，比如令人恐惧的肠细菌、葡萄球菌和大肠杆菌等。任何其他材料（例如银离子涂层或不锈钢）都无法与之相比媲美。

铜能够快速杀死MRSA这样的超级细菌，并且令细菌无法产生抗体，铜质水龙头内壁不会滋生细菌，这是其他材料(如：不锈钢、塑料)所不具备的优势。纯铜内胆，细胞培养的明智之选.

铜腔体 CO2 培养箱
Steri-Cycle i160 灭菌Steri-Run (180°C)
Steri-Cycle i250 灭菌Steri-Run (180°C)

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噬斑工业应用案例参考： 有时候不是分离不到病毒，是细胞维持培养时间不够，特别是难分离，新的病毒，热点应用等，从零到一是重中之重。细胞维持培养是关键，经五年腺病毒、溶瘤病毒，细胞种子库级别试剂，细胞工厂应用等相关技术储备冗余工业试剂提供商应用特点，我们促贴壁起到关键作用。
我的案例图怎末传不上来，要能传上来图，后面我们简易方法单克隆图也很漂亮，噬斑应用已经可顺利筛出共生病毒，可讨论细节了。

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原代建系更新参考 组织-细胞要点
1：离体处理，建议手术刀并排两三个固定后，冰上最快速度处理，建议十分钟内入皿。
2：不管哪种培养体系，都要有一组含血清，这个每个实验室都很熟悉，上清前几代留着，后面建系中，细胞受损后救助（冻存复苏，长期培养驯化过程中细胞状态差等救助），类器官，无血清方案两年统计结果给出含血清参考。含血清优势是可行，每个实验室都熟悉相关足够的经验与问题解决，还可先成功，大量细胞拿到，有充足的细胞后，在评测无血清。
3：冻存复苏：建议两指厚面包裹后直接负80后，第二天液氮，有泡沫冻存盒裹在棉花外面效果更好，建议平时冻存复苏评测。较挑剔的有免疫细胞，原代等测试效果比较好，无血清方案，建议新式冻存方法评测比较。
4：建系病毒要点：高滴度。
5：技巧参考：要对细胞镜下形状熟悉（或者先筛选目的细胞有个大概判断后），可不用分离液，流式等前期筛选，单克隆多做些，等大量培养后在做相关检测，避免分离液化学损伤，流式机械损伤而使细胞建系培养不顺利问题。大大提升成功率，上述1-3是组织到细胞，4是难感染细胞痛点，要能理解上述要点，重复实验容易并可行，也是建系简单重复关键。
组织-细胞    细胞-组织   难养细胞系参考统计，上皮，SV40 （原代要熟悉培养特性，正好与难养系长满传代时间一致。）缺氧培养应用优势整理中，缺氧培养优势是成干后，细胞分化控制目的（相关文献建议看成干后动物模型验证）
6：传代培养注意：千万别按细胞系传代习惯，总是拿出来开看细胞（这点尤为重要，关乎成败）建议多放50%完全培养基后，4-7天传代合适，成纤维，内皮，上皮首代消化费劲，建议考虑组织-细胞处理步骤影响的组织活性，例如操作步骤全程冰上，快，（消化液选择不合适，时间过长等因素），树突，kuffer，难消化建系工业用途可来信告知，这类我们可试完成建系难点痛点建系（我们拿技术换口饭吃）
SV40建系培养特点，细工技术储备充足（国内建系做技术储备），如您建系也用SV40,如遇到问题，可讨论。问题结合统计有些共性，也有组织特性，可讨论。
人肾皮质近曲小管上皮细胞；HK-2    人乳腺上皮细胞；MCF-10A     人肺正常上皮细胞BEAS-2B     人肝癌细胞；Hep G2 [HepG2] 上皮样      人胚肾细胞；293 [HEK-293] 上皮样   人脑星形胶质母细胞瘤；U-87 MG [U87MG；U87 MG] 上皮样
后期相关问题统计
维持培养：维持培养验证建系，种子库等重要实验试剂筛选推荐，细工内部应用维持培养，在高产蛋白，培养基血清试剂评测种子库，生产应用做技术评测，外泌体应用，噬斑工业应用都取得了不错的效果。
控制分化：缺氧，成干，维持培养应用后续在统计讨论
离体后开关通路（细工优化胰酶解决这个问题，胰酶经过各种胰酶敏感细胞系长期统计筛选，胰岛胰腺类细胞系），也是离体后首代培养关乎成活关键。
细胞痛点讨论及参考-系验证可行性，原代应用有理由
问题关于黑点
细工建议参考，用对试剂耗材（种子库级别细胞不建议用便宜试剂，保种上百只种子细胞，也用不了多少钱的）胰酶轻柔处理（避免枪直接吹打细胞损伤也是较重要指标参数），几代或十几代后，黑点会全部消失。这个建议也只是救助办法参考建议，经历过黑点的细胞，建议重新保种国内正规库来源细胞。
问题细胞系生长慢-原代生长慢-细胞养几代后就爬爬这种情况
细工建议参考 给出方案是进口瓶培养（康宁，nunc,德国产细工全部现货） ，种子库级别试剂（三千以上胎牛，我司验证五年以上南美）我司培养基或者是GIBCO培养基，放足培养基（多些也没关系）几天不动，看下恢复情况，结合我司胰酶（无损消化）传几代应该能找回较好状态，该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况（上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况，该因素原因很多，具体情况集体分析）该方法也建议原代首代培养（类器官）就是普通培养基加胎牛（因子贵，lag phase长、无血清不稳点）全部能替代，细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。
成瘤不稳定组参考，技术老师参考
瓶，慢养慢传代慢生长，无损胰酶，少二氧化碳，减缓生长，减缓分化，理由：来自成干成球培养，难养细胞株痛点统计规律相似特点。分出一批评测，操作更简单，给成瘤不稳定组，提供一组备份条件，从成干特点上看（缺氧培养减缓细胞分化-这个特点又能起到明显作用后，我们可能考虑离体后巨噬培养看看能否控制细胞分化，后面给生产型用户做些技术储备），优势挺大的，也给出一套备份技术储备。
备注：如您对干细胞培养相关了解，相关参考也可发我下，我们一起验证优略。该思路来源类器官统计可行性及目前试剂耗材国产普及，我们目的是国产试剂耗材原代建系。冻存复苏优化应该也是原代建系中重点，相关问题心得都可讨论。
建系应用，蛋白互作用应用，生产应用，等需要细胞状态更好为目的，细工在噬斑，稳转株应用都取得了不错的效果。噬斑成功筛选十天维持培养，筛到单克隆株。稳转株应用，稳转株细工强推，超级量加药筛选，传代加药，复苏加药筛选。超量加药目的是避免假阳性，成功率大大提升，筛出目的细胞。实验室实现量产蛋白，相关冗余试剂技术开发。
优势：免无血清，不用昂贵的转染试剂，含血清细胞工厂容错率高。外泌体，蛋白生产，维持培养所想接可得，欢迎出口商加盟。

成干验证，减血清，增长速度很有参考意义。
当单一的畸胎癌细胞种植到胚胎上时可以长成良性组织(Kleinsmith and Pierce，1964)，这提示在转化的细胞中表型改变是可逆的。
以至诱导分化经常被推荐作为肿瘤治疗的模型(SpremulliandDexter, 1984;Freshney,1985;Marks and Breslow,2007iccirillo et al.,2006; Wang et al.2008:Kangetal，2014)。
北医白凡，生物物理所-李翀老师，10-1000个细胞成瘤五六年前文献可查下，完成上述验证，一瓶25培养瓶可接种几只动物，从成本上可大大降低培养中血清成本，并在采购血清上用到最好级别试剂。
上述三种痛点总结目的，给国产建系提前做些技术储备统计。如需验证，可沟通具体内容。

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增强型贴壁试剂
可发试用，相关技术储备较多。
要能沟通，应用细胞，目的产物能否告知，了解目的是生产型产物出口业务对接，印度为主。效价是关键技术指标，我们可配合用户做上游工艺开发，提高产能，降低成本，细胞缓冲能力更强为最要点，看您需求，您公司要有出口业务，可做回信标记，我们刚开始做出口，业务这块还不是很熟悉。请教学习。

应用案例一，该产品上游开发已成熟，随时能转化生产，
该试剂优势就是维持培养，对细胞无损，延展应用工业疫苗生产（溶瘤蛋白生产泡内产物）、外泌体维持培养、上清物分泌各类需求（脐血脐带上清分泌工程应用）。
工业案例详细参数参考：采用 LMH 细胞生产禽腺病毒疫苗，常规基本都在 107.0/0.1ml 左右，极大地限制了产能。该试剂应用后，4 型禽腺病毒病毒 TCID50 效价大于 108.5/0.1ml（，使 LMH 细胞贴壁时间大为缩短，而且细胞培养 192h 后仍保持较好细胞形态， 易于禽腺病毒病毒的复制与增殖及后续毒价测定。4 型禽腺病毒病毒 TCID50 效价大于 108.5/0.1ml，目前 1ml 全病毒培养液可配制 200 羽份疫苗，可 100%保护 SPF 鸡免受 4 型禽腺病毒强毒的攻击（未免疫组攻毒 72h 后 100%死亡）。该试验结果由不同厂家不同 专业人员多次在细胞工厂上验证完成 。
以上试剂及工艺都成熟了，想咨询下出口要求，该技术水平随时可第三方验证（无替代，国内国外），邮件联系。
应用案例二，附件中案例图片
噬斑工业应用案例参考： 有时候不是分离不到病毒，是细胞维持培养时间不够，特别是难分离，新的病毒，热点应用等，从零到一是重中之重。细胞维持培养是关键，经五年腺病毒、溶瘤病毒，细胞种子库级别试剂，细胞工厂应用等相关技术储备冗余工业试剂提供商应用特点，我们促贴壁起到关键作用。
案例细胞：LMH,维持培养第十天出现噬斑，用户已完成单克隆保种，有相关需求用户要深入讨论难点，建议试剂耗材，厂家型号，培养特点，目的要求，告知详情，我们们给出参考建议，有国外疫苗生产商用户的商家，我们可送试用及解决方案。也可做第三方验证。细胞工厂含血清方案为基础。附件是十天噬斑图片参考。
涉及要点：胰酶消化，维持培养基应用、促锚着，瓶养控制PH变化等，具体问题具体分析。
应用案例三，
生产用稳转株构建痛点优势
超剂量筛选稳转株  1：高于正常计量加药   2：带药传代    3：带药复苏
工业优势： 稳转株筛选后，普通培养条件（减少成本），常规实验室（可行性高），无需添加贵重设备，目的蛋白表达14天培养（细胞维持培养状态优势），可完美完成含血清无血清各种需求。实验室高手欢迎参与，我们对接药企联合开发及应用（变现快），各种难点痛点欢迎提问。各种无血清，转染试剂全免。
应用案例四，国内溶瘤病毒研发生产基于293细胞已有四年以上平稳订单，五家以上用户。
应用案例五：科研户救助细胞，珍贵细胞（复苏后细胞不锚着）蛋白互作用共聚焦，原代替代胶原酶优势，成瘤不稳定组细胞系，黑点，生长慢救助后，配套消化无损胰酶也很关键。具体细胞具体分析。

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冻存复苏，建系重中之重
成团成片，转染效率不高（悬浮免疫，原代请注明）堆叠式生长（类似类器官），原代首代传代后消化不下来（该问题简单解决是，在培养瓶用前铺曾血清）高级解决来信告知详情，给出参考建议(近年流行关键词：反转法，免疫类促贴壁转染，原理都差不多）

胰酶法解决

可用复苏活率不高细胞验证，原代，细胞系都可以，告知细胞名称，生长特性，以前冻存方法，活率多少（是否含血清），目的要求，目前原代PBMC案例活率70%,三年统计数据，案例很稳定。（全血清+DMSO),关于程序降温可讨论细节。

20240629

对冻存挑剔细胞THP-1（免疫类）、胰岛胰腺类（原代，系）上皮类、原代、原代血液类
更挑剔细胞：耐药株，稳转株，国内建系，生产用种子库、各类原代。
后面碰到无解无文献支撑等难点痛点都可以讨论。（细工为国内建系，超量培养，维持培养做些技术储备目的，比正常系，原代增殖天数差距太大，适合细节讨论，提升增殖速度，主路线提供简易可行方法，提升组织细胞活性，含血清解决为主快，无血清涉及周期长慢，培养基中各组分统计开始）

讨论上述对细胞冻存细胞平时验证推荐，讨论理由，就是冻存前消化成单个，胰酶敏感重要性，这个我们总结有，巨噬系，原代，免疫系，肝类、原代，胰岛胰腺，上皮，腺类，腺类神经类共存系，淋巴类SV40,hTERT
THP-1,正常细胞系。生长特性：成团成片，堆叠生长。（试剂耗材种子库理念一致，要找到复苏活率稳平，多年长时间验证）
这步解决好了，在用经典冻存（经典一定要自己预实验为准），建议做到理想效率是，不管是那种细胞（，活率都在80%以上
细工方案要点提示：①冻存前胰酶处理（细工胰酶经过胰酶敏感细胞测试，提高活率关键步骤，这部验证成功，还可用到转染前细胞质量提升，大大增加转然后成功率，其他救助办法这里不展开，有需要可来信讨论）。②高质量血清，这部分验证成功，后面种子库试剂，正规库来源细胞救助，试验后死细胞过多，细工是通过免疫细胞，巨噬分化比较了不少厂家。实验涉及到分化影响可发试用比较。③促贴壁：特别是上皮类，这类包括很多难养系大部分是上皮类、腺与神经、免疫类特点都包含得系，特点是容易成球，成球速度比贴壁速度要快，我们持续统计这类问题解决目的是建系，和规模培养为后续超量培养，维持培养做些技术储备。目前有些小进展，涉及方法太多，这类先不阐述，有兴趣用户可来信讨论。
您建系，我全程陪同，总觉得冻存复苏这个很重要。