【前沿速递】现有药物通过靶标 NS2B-NS3可作为寨卡病毒广泛的强抑制剂

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背景知识
  黄病毒属由70多种病毒组成，其中许多会导致具有全球影响力的严重人类疾病，如，登革热病毒（DENV），黄热病病毒（YFV），西尼罗河病毒（WNV），和日本脑炎病毒（JEV ）。自2013年以来，随着寨卡病毒的大幅爆发，全球范围内重新出现了由蚊虫传播的黄病毒。重要的是，寨卡感染导致了全球危机，因为其引起了睾丸损伤，眼损伤，格林-巴利综合征，胎儿畸形，和其它潜在神经疾病等并发症。

  近期寨卡病毒的爆发突显出了治疗的迫切需求！最新研究动态发现，蛋白酶复合物NS2B-NS3在黄病毒多蛋白前体加工过程中起着重要作用，是一个非常有吸引力的药物靶标！


  2017年7月7日，《Cell Research advance》提前在线发表了Zhong Li等人题为“Existing drugs as broad-spectrum and potent inhibitors for Zika virus by targeting NS2B-NS3 interaction”的研究性论文！

   该研究开发出了一种新型的测定法，即基于荧光素酶互补（SLC）的高通量筛选（HTS）方法。并通过该方法从NCGC的2816种药物中筛选出了三种有效的化合物，其中替莫泊芬最为有效！最有效的化合物替莫泊芬不仅抑制了人胎盘和神经祖细胞中的寨卡病毒的复制，而且在小鼠模型中还避免了寨卡引起的病毒血症和死亡。本研究结果可为迅速解决迫切需要有效抗寨卡的药物提供重要的可能性。

文章概况：

1、基于SLC的NS2B-NS3相互作用测定，并对SLC特异性和亲和力测定。实验结果表明，NLuc-E66stop / GCN的SLC信号特异于NS2B和NS3之间的相互作用。


Figure 1 The DENV2 NS2B/NS3 SLC assays.


Supplemental Fig.S1 Schematic diagram showing the firefly SLC strategy to monitor PPIs and principle tp screen inhibitors.

2、SLC对已知的orthosteric抑制剂行分析，结果表明了SLC HTS测定为筛选化合物以干扰NS2B-NS3相互作用提供了可观的策略。随后利用qHTS对现有药物作为NS2B-NS3相互作用的抑制剂进行鉴定，阐述药物对蛋白酶抑制的表征。实验结果表明，三种化合物，即替莫泊芬，氯硝柳胺和硝唑尼特，能有效抑制NS2B-NS3蛋白酶活性，其IC50-pro值为1.1〜15.9μM。



Figure 2 HTS assay identified potent orthosteric protease inhibitors.



Supplemental Fig.S2 Gel filtration profiles for purifications of the MBP-NS3.



Table 1. Protease inhibition, cytotoxicity, and broad-spectrum anti-flavivirus activities.

3、药物作为有效抗寨卡病毒（ZIKV）抑制剂的鉴定，通过定量实时PCR（qRT-PCR）和免疫荧光测定等实验指出，替莫泊芬，氯硝柳胺和硝唑尼特这些药物的添加大大降低了病毒RNA拷贝数和病毒抗原表达。此外针对三个药物的研究表明，替莫泊芬是非常有效的ZIKV抑制剂。



Figure 3 Drugs are potent inhibitors of ZIKV and DENV2.
                                            
Supplemental Fig.S3 In vitro antiviral activity of Tempoporfin against ZIKV strain GZ0164

4、为了研究这三种化合物的抗病毒效能，作者在HPEC中测试了它们的抑制能力。实验数据证实了对于寨卡感染的细胞，这些化合物起到了很有效的作用。此外这些化合物还能降低人类肝细胞干细胞的神经前体细胞中 ZIKV的滴度。而且，替莫泊芬和氯硝柳胺不仅在病毒感染的早期阶段起作用，而且在病毒复制的后期也是ZIKV的有效抑制剂。



Figure 4 Inhibition of ZIKV in cells relevant to ZIKV.

5、替莫泊芬有纳摩尔抗ZIKV效能，可体内保护小鼠免受ZIKV致死性攻击。



Figure 5 In vivo antiviral activity of temoporfin against ZIKV.

6、此外，实验结果还指出，体外替莫泊芬，氯硝柳胺和硝唑尼特可特异性破坏病毒NS2B辅助因子和NS3蛋白酶结构域之间的相互作用。通过蛋白质热位移测定（PTSA）研究这些化合物与NS3的结合，发现三种药物都与NS3蛋白结合，导致NS3构象的稳定，并使Tm值增加。其中替莫泊芬与NS3具有最高的结合亲和力，最有效的NS2B-NS3抑制剂。



Figure 6 Drugs directly bind to the NS3 protease domain and disrupt interactions between NS2B and NS3.

7、通过蛋白质印迹分析检测化合物抑制病毒蛋白的表达证实了，抑制NS2B-NS3相互作用的抑制剂消除蛋白酶活性，导致多蛋白前体（PP）的积累。



Figure 7 Drugs inhibit viral polyprotein precursor (PP) processing.

8、药物与黄病毒NS3蛋白酶结合的建模，以替莫泊芬作为模型，证明了配体与NS3残基R24，N27，Q28，K33，R54，T59和H60之间的相互作用。



Figure 8 Induced fit docking of drugs to the NS2B 2B51 and 2B53 pockets on NS3pro.

   本研究中结构嵌合表明，替莫泊芬可能结合于NS2B上的NS3 位点，从而以非竞争性方式抑制黄病毒多蛋白加工。由于这些药物已经在美国及其他国家已被批准用于其他适应症的临床应用，因此有希望作为寨卡和其他黄病毒感染引起相关疾病的治疗方法。
  目前尚不知道我们研究的药物可能有多长时间有效。虽然可能需要进一步调查，但这些新发现表明ZIKV的治疗窗口相对较大。尽管如此，鉴定现有药物作为ZIKV的有效抑制剂是治疗ZIKV和黄病毒十分重要的一步！

文献相关信息：
doi：10.1038 / cr.2017.88
Abstract:
Recent outbreaks of Zika virus (ZIKV) highlight an urgent need for therapeutics. The protease complex NS2B-NS3 plays essential roles during flaviviral polyprotein processing, and thus represents an attractive drug target. Here, we developed a split luciferase complementation-based high-throughput screening assay to identify orthosteric inhibitors that directly target flavivirus NS2B-NS3 interactions. By screening a total of 2 816 approved and investi- gational drugs, we identified three potent candidates, temoporfin, niclosamide, and nitazoxanide, as flavivirus NS2B- NS3 interaction inhibitors with nanomolar potencies. Significantly, the most potent compound, temoporfin, not only inhibited ZIKV replication in human placental and neural progenitor cells, but also prevented ZIKV-induced viremia and mortality in mouse models. Structural docking suggests that temoporfin potentially binds NS3 pockets that hold critical NS2B residues, thus inhibiting flaviviral polyprotein processing in a non-competitive manner. As these drugs have already been approved for clinical use in other indications either in the USA or other countries, they represent promising and easily developed therapies for the management of infections by ZIKV and other flaviviruses.
Keywords: Zika virus; inhibitor; protease; NS2B-NS3 Cell