PCR鉴定阳性的重组Bacmid甘油菌摇菌后提质粒，再进行PCR鉴定竟然为阴性？

cao1976

原贴由夏天的雨发表于 2011-8-17 20:25
http://biosky.haotui.com/thread-24732-1-4.html

最近在做杆状病毒表达，由于第一次转染后，进行蛋白表达鉴定未成功，所以打算重新做一次转染，但将-80度保存的PCR鉴定阳性的重组Bacmid甘油菌摇菌后提质粒，再进行PCR鉴定竟然为阴性？请问原因。难道每次都要重新转化获取重组Bacmid吗？我将重组Bacmid甘油菌划线3抗平板后，均为白色菌落，应该是重组成功且没有丢失的啊。希望能在杆状病毒学板块发帖求助。谢谢!

追问：PCR之后无条带。之前保存的甘油菌是经过两次划线挑取的单菌落，还有，我以前用M13上下游引物PCR鉴定时，除了目的条带外，均有一条1000bp多些的条带，包括空载体对照也是（一条2500bp左右的带，一条1000bp多的带）。不知道是什么原因？而用M13上游引物和自己插入基因的特异引物进行鉴定，便只有一条目的条带。

以下为会员回复：
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stare024 发表于 2011-8-18 09:33 ：蓝白斑只是初步筛查，有时候会出现假阳性，甚至假阴性。白斑，不一定就是对的。

你甘油菌保存之前P出的目的条带有没有测序验证？
另外你用的哪个载体？不同载体对转座后M13验证的条带大小是不一样的，
而且单从条带大小无法判断转座是否发生。
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stare024 发表于 2011-8-18 10:47 ：pFastdual，因为转座后 载体上包括目的片段和载体本身的序列，如启动子等也要转到bacmid中去。
所以，转座后bacmid用M13引物P出的片段包括原载体上Tn7位点之间的序列。
所以空载体是有2500的片段的。1000的条带不知道是什么，可能是污染。

建议把甘油菌划线挑单克隆，在进行鉴定，PCR、酶切只是初步验证，最终还是测一下序列。
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Siny 发表于 2011-8-20 12:22 ：第一次转染后见不到蛋白看不到细胞病变都很正常，进行第二次传代，我的在第二代的第五天出现明显病变并且检测到蛋白