昆虫病毒蚀斑实验测滴度看不到空斑

cao1976

原贴由anjohnlee发表于 2010-1-15 09:55
http://biosky.haotui.com/thread-13305-1-1.html

我的空斑实验总是看不到空斑，请大家讨论指导。以下是实验步骤：
1.  6孔板按每孔1.5X106细胞的量来接种，1小时后观察，覆盖率大概50%-60%，细胞均匀铺开。
2.  稀释病毒，从10的1次方一直到10的8次方，然后去掉6孔板里的旧培养基，分别加入稀释后的病毒液1ml，27oC感染1h。
3.  70oC水浴大概30min融化4%琼脂糖（Invitrogen），然后加入三倍体积的预热到42oC的CCM3（Hyclone）培养基（2%血清），混匀，42oC保温。
4.  待感染1h结束后，迅速洗掉每孔里的病毒液，加入保温的琼脂糖，无菌台内静置20min待其凝固。
5.  放在铺有湿滤纸的饭盒里，饭盒外裹保鲜膜，放置在27oC生化培养箱中6-10天。
实验全程使用含2%小牛血清的CCM3培养基（Hyclone),平时的细胞培养（贴壁培养和悬浮培养都是用的这种培养基）。


肉眼始终观察不到空斑（据说是灰白或乳白色）。显微镜下能看到有很多10个细胞左右的面积上没有细胞或有明显的细胞碎片（一团小黑点），但是与周围的细胞没有颜色上的区别或界线。
较高的稀释度病毒液感染后的几个孔的细胞明显有感染症状（2，3次方稀释的孔）。
放置9天后，所有孔的细胞都有不同程度的死亡，然觉不像是干死的，因为6孔板外表有水滴，内部也有一个孔有明显的水（倾斜会有水流动）。自然死亡的细胞会不会影响空斑的观察？
是不是一定得用中性红染色，肉眼根本就看不到空斑？

请问肉眼观察时，空斑和周围的细胞有明显的界限么？
哪位能发张带空斑的照片上来？
会不会是我用正常浓度的培养基稀释琼脂造成营养物质不够而使细胞状态、病毒感染受影响呢？可否在凝固的琼脂糖上再加一点液体培养基呢？
重复做了3次都是这个样子，实在不知道到底怎么样才能看到空斑，急需您的指导，非常感谢！

cao1976

sas00hc 发表于 2010-1-15 15:17 ：我们做空斑实验的时候，都在琼脂糖上面加上1ml的培养液。空斑明显的时候不染色也能看到，但染色后更清楚。建议你用中性红染色后看看。

放置9天时间太长了。自然死亡的细胞太多会影响空斑的观察。感染3-4天就足够长了。

cao1976

半拉木匠 发表于 2010-1-15 22:35 ：昆虫的没做过 人的做过
    琼脂封闭那么久 营养成分不够时肯定的了。 在琼脂上加些培养液吧
    另外  琼脂的温度可以再降低点不？  不知道你的病毒是不是热敏的？ 会不会是加的42度琼脂给烫死了，那么短的时间虽然细胞不会烫死  但是病毒就不一定了。CPE  一旦形成了  即使不染色 也能看见的 。

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