绿色荧光蛋白

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绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。近年来，随着GFP在各种异源细胞，如细菌、昆虫及植物细胞中的表达，GFP作为一种新型的报告物在生物学界引起了广泛的关注，关于它的基本结构、生色团、发光机理及基因的改造均有大量的研究报道。
1 GFP的发现过程
1962年，Shimomura等首先从多管水母(Aequoria victoria)中分离出一种称为水母蛋白(aequorin)的蛋白，它是分子量为20kD的单一多肽链。lmol的水母蛋白结合3mol的Ca2+及lmol非共价键结合的腔肠动物荧光素后，可发射蓝色荧光。1992年Prasherc。 等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一级结构，1994年Chalie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。

2 GFP的发光特性与机制
GFP是从水母分离出的一种天然荧光蛋白，分子量约27000。。为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽，其荧光发射峰在509nm，最大激发波长为395 am，并在470 am处有一肩峰，GFP的化学性质相当稳定，其变性需在90℃或pH<4．0或pH>12．0的条件下用6mol／L盐酸胍处理。GFP的荧光发光机制还不清楚，GFP有两个明显的吸收带，对应于GFP的两种不同构象的基态A和B。基态A对应于395nm的吸收峰，基态B对应于475nm的吸收峰，基态A占优势，基态B的分子数量约是基态A的1／6，两种基态间能缓慢地转换，但激发态A 之间的转换很快且发生了质子转移，A 快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态I，质子转移使A 转变成I ，I 回迁到基态I时产生发射峰504nm的荧光，构象改变使I 转变成B ，由B到B发射荧光而不发生质子转移。目前，对于GFP的作用机理较为认同的仅仅是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。

3 GFP的应用特点
3．1 GFP的优点
(1)易于检测。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。
(2)荧光稳定。GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照GFP在pH7~12范围内也能正常发光；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数都有较强抗性。 ’
(3)无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。
(4)通用性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。
(5)易于构建载体。由于GFP分子量较小，仅为27~30kD，编码GFP的基因序列也很短，为2．6kb，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。
(6)可进行活细胞定时定位观察。对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过GFP可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的激光扫描共聚焦显微镜，结合强大的计算机软件，可进行三维显示。
(7)易于得到突变体。GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。
3．2 GFP的改进
①除去GFP基因中隐蔽剪接位点(crypticsplic site)或隐蔽型内含子(cryptic intron)；②消除编码蛋白的积累；③将GFP定位到特定细胞器中；④改变碱基组分；⑤更换GFP生色团氨基酸；⑥插入内含子；⑦增加增强子和更换强启动子。
4 GFP的应用
4．1 报告基因和细胞标记
GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中，GFP最大的缺点就是没有放大作用，它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大。所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量的表达。也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物，靶入的基因被限制于一个细胞器内，GFP的浓度则相对提高了许多倍。
4．1．1 融合标记 应用得最多和最成功的是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位和最后归宿，既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳，GFP可融合于宿主蛋白的N端或C端，也可插入其内部。迄今为止，GFP已成功地靶入了大部分细胞器中，如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、
线粒体、液泡和吞噬体等。
4．1．2 GFP基因作为免疫标记物 利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。
4．2 研究活细胞的蛋白变他过程，细胞器动力学和内膜运输通过GFP可研究某一蛋白在活细胞中的动态变化，药物对蛋白的功能影响的动态过程以及蛋白之间的相互作用．避免了提纯蛋白，标记上荧光染料，用显微注射导入细胞的复杂方法。也可对信号转导系统的某一蛋白进行动态跟踪，研究其分子机制。如GFP与MAP4基因连接后，GFP—MAP 4定位在微管上，用显微注射的罗丹明一微管蛋白共定位证实该结果，因此用GFP的荧光就观察微管的动态变化。GFP与分秘蛋白clromogranin B相连后转染细胞，可动态观察该分泌蛋白分泌到胞外的过程。GFP与生长相关蛋白GAP 一43基因相连后，观察到GAP一43靶向定位在神经元质膜上，在活脑切片感染实验中，被标记上GFP荧光的大部分细胞为胶质细胞。GFP融合蛋白也已用于研究植物内膜系统以及各种细胞器的结构和功能。含有特定的定位序列的GFP融合蛋白使GFP定位于特定的细胞器和植物内膜系统，从而便于活体观察。
4．3 GFP基因在生物防治中的应用目前生物农药的杀虫效果往往得不到准确评估Yu—chan Chao等用GFP标记AcNPV，通过荧光观察，可以避免评估AcNPV 杀虫剂杀虫效果时仅仅记录有典型感染症状的害虫个体而忽视无明显感染症状但确实已经感染或正在感染的害虫个体，同时无需进行分子生物学鉴定即可方便地区分杀虫剂致死和天然病原致死，从而客观准确地评价杀虫剂的毒力。
4．4 GFP在微生物学中的应用
在活体研究中，GFP相对于其它报告蛋白(如口一半乳糖苷酶)在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾，对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、
蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论，并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。GFP分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭，但同时也降低了GFP分子的荧光对环境的敏感性。通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP，它们可用作环境指示剂。
5 问题与展望
尽管GFP基因作为新型报告基因越来越受到关注，但毕竟只是近几年的时间，对GFP的基础理论研究远赶不上其应用的速度，目前还存在许多问题，如荧光强度的非线性性质使其定量非常困难；多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，影响某些GFP的检测；新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式，过程十分缓慢；紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用，导致荧光信号快速丧失等。但是GFP是生化和分子细胞生物学中飞速发展的一个工具，它已经渗透到了分子生物学、遗传学、动物学、植物学、生理学等其它许多生命科学领域。随着对GFP的基础理论研究的深入和新型突变体的不断出现，我们有理由相信这些问题终将得到解决。GFP工程，包括GFP蛋白工程和GFP基因工程的迅速发展，使其在理论研究和实际应用中产生更大的价值相信随着基因工程技术和细胞工程技术的El益成熟，GFP一定可以为我们揭开生命科学中许多迄今为止还不为人所知的秘密。