[转移贴]肠道病毒71型（EV71） by 李兰娟

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肠道病毒71型（EV71）
   
作者：李兰娟  出版社：浙江科学技术出版社
        肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员，归属于人类肠道病毒A。1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病（1969～1973年）的患者中分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了EV71病毒在不同地区的流行情况，EV71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行，人们逐渐认识到EV71病毒是手足口病的主要病原。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎（asepicmeningitis）、脑炎（encephalitis）和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病（poliomyelitis-likeparalysis）等多种与神经系统相关的疾病。EV71可导致大范围的暴发流行，可伴有严重的CNS并发症或致死性肺水肿。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，1975年保加利亚大流行,共有705名患儿感染，死亡44例；1997年马来西亚大流行感染2628人，死亡30多人；1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。
              一、病毒的一般特征
           （一）病毒颗粒结构
       该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。如同其他肠道病毒属成员一样，EV71型病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30 KD、26KD和7KD的多肽VP1(α)、VP2（β）、VP3（γ）、VP4（δ），构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位（pentamericunit），60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。EV71病毒由于没有类脂膜，所以它对乙醚、脱氧胆酸盐、去污剂以及弱酸有抵抗性。此外，该病毒还能抵抗70％乙醇和5％甲酚皂溶液等常见的消毒剂，但是高温（56℃，30min）处理和紫外线照射可以很快将病毒灭活，它对各种氧化剂如高锰酸钾、双氧水、漂白粉等也很敏感。
            （二）基因组结构
      EV71病毒的基因组为含有大约7411个核苷酸（7423/MS/87株）的单股正链RNA，腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富（A+U=52.8）。RNA中仅有一个开放阅读框（ORF），编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区（UTRs），它与其他肠道RNA病毒一样，在3′末端有多聚腺苷酸（polyA）尾，而其5′末端共价结合有一个小分子量的蛋白（VPg）。病毒的单链RNA具有感染性（病毒裸露RNA的感染性仅为病毒颗粒的百万分之一），如果去除3′末端的多聚腺苷酸尾或基因组出现断裂，感染性便消失。相对而言，其5′末端连接的蛋白质对病毒的感染性没有明显的影响。
      
      
               EV71基因结构图
                 (中国疾病预防控制中心提供)
         该病毒的基因组从5′末端至3′末端依次排列着含有746个核苷酸的5′非编码区（untranslation region，UTR）、编码区1A（多肽VP4)、1B(多肽VP2)、1C(多肽VP3)、1D(多肽VP1)、2A（特异性蛋白酶）、2B、2C、3A、VPg（5′末端结合蛋白）、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组分)、3′末端非编码区（83个核苷酸）以及多聚腺苷酸尾（AAAn）。病毒RNA正链和负链的5′末端和3′末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成的起始信号，VPg蛋白通过其酪氨酸残基的羟基基团与RNA5′末端的pUpU 形成的磷酸二酯键与基因组RNA结合。
        5'UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译过程中发挥重要作用，此外，5'UTR结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。EV71病毒基因组3'UTR区和多聚腺苷酸尾的功能目前尚不清楚，但是对EV71病毒处在同一属的其他成员（如脊髓灰质炎病毒）基因组尾端多聚腺苷酸的研究发现，如果减少病毒基因组尾端多聚腺苷酸的长度，会降低病毒的感染性。
                （三）EV71病毒基因分型研究
        EV71病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据．并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。目前基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及c1、c2、C3和C4亚型。Brown等曾对113株世界各地的EV71分离株的VP1基因的核苷酸序列进行同源性分析，显示同一型内毒株间序列同源性大于92％，而不同型问毒株的同源性为78％ ～83％。自1997-2001年期间在马来西亚、新加坡、中国台湾和澳大利亚西部等地流行期间分离到2个新亚型，即B3和B4亚型，其中B3亚型为东南亚地区的流行株。B4亚型曾在新加坡(1997-1998年)和中国台湾(1998年)小规模流行，但2000年在马来西亚和新加坡大规模流行，成为流行株。B基因型主要包括美国、澳大利亚、哥伦比亚、新加坡、部分中国大陆与中国台湾地区、部分马来西亚的毒株；而C基因型主要包括美国、澳大利亚、中国大陆与中国台湾、加拿大和部分马来西亚的毒株。B和C基因型在系统发生树上遗传距离较远。中国台湾1998年EV71大爆发是由2个基因型，即B和C2同时引起的，但Shih等比较了其流行期间从死亡病例中分离的18株毒株，结果表明，有l7株分离毒株为C2亚型，仅1株为B型。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型，提示该C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。EV71病毒衣壳蛋白VP2和VP4是肠道病毒外壳蛋白的主要组成部分，它们与病毒的抗原性密切相关 ，基于VP1与VP4的基因分型具有很高的相关性。
                              
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             （四）EV71病毒致病的毒力决定簇
        EV71病毒毒力决定簇的确定依赖于分子遗传学的研究，主要取决于两点：一是要有足够的具有高等或中等毒力的分离株，并通过分子流行病学研究方法确定与毒力相关的特定核苷酸位点；二是要有较好的动物模型进行毒力表型验证。然而与毒力相关的特定位点的确定相当困难，这是因为：1.毒力决定簇在EV71基因组中并非单一位点，病毒的毒力是多个位点共同作用决定的；2.复杂的宿主困素，如宿主抵抗力水平的差异以及宿主对肠道病毒属内的不同病毒存在免疫交叉保护反应等。动物模型也是EV71分子遗传学研究的一个障碍，虽然实验室小鼠常作为EV71感染的动物模型，但EV71只对出生4天以内的小鼠敏感，对出生6天以后的小鼠就完全不敏感。猕猴是EV71感染的较好的动物模型，也能引起类似于人类的中枢神经系统症状，但由于猕猴价格太高，无法满足实验室大量的实验需要。McMinn等对1999年澳大利亚流行的EV71的VP1基因进行了序列分析，发现属于同一亚型(C2)的分离株中，只表现HFMD的分离株与具神经毒性的分离株的主要区别在于第170位氨基酸的不同，前者为丙氨酸，而后者是缬氨酸。EV71的VP1蛋白的第170位氨基酸是非常保守的，可能正是这一个氨基酸的变化，改变了VP1蛋白的空间结构，导致病毒与受体结合能力下降，从而使其毒力发生根本的改变。但有关EV71毒株基因型与毒株致病力、神经毒力的关系目前尚无定论，大部分研究认为，EV71的VP1基因与疾病的严重程度无明显关联，因所有基因型均能引起严重的疾病。
      
               二、病毒的感染与繁殖以及病毒基因组的转录与表达
              病毒感染过程的第一步是病毒通过与位于细胞表面的特异性受体结合而吸附于被感染的细胞的表面，然后利用细胞的内吞作用进入细胞或将病毒的核酸释放进细胞。其中病毒的特异性受体不仅参与决定病毒的组织嗜性，而且在诱导细胞发生内吞的过程中扮演重要角色。肠道病毒属中许多成员的受体已相继被发现，例如脊髓灰质炎病毒受体（poliovirus receptor，PVR）、柯萨奇病毒受体－细胞间黏附分子1（intercellularadhesion molecular1，ICAM-1）和埃可病毒受体（VLA-2）等。但是目前对于EV71病毒的受体了解不多，通过酵母双重杂交分析显示，VP1主要与3个人类蛋白结合，即：鸟氨酸脱羧酶（ODC1）、基因套锚蛋白重复序列（GTAR）和在脑组织中表达的KIAA0697。而VP1与ODC1间的相互作用可能与EV71的潜伏激活有关，能干扰受EV71感染的细胞的生物合成，生长和增殖。同时VP1与GTAR间的相互作用使得EV71通过锚定蛋白中枢神经细胞的黏附分子结合，从而与CRASH神经学症状密切相关。VP1蛋白在蛋白表面形成的峡谷（canyon ）样结构是受体分子的结合位点。
         病毒与受体结合的同时，病毒颗粒的空间构型改变，丢失VP4，最终脱去病毒的外壳并释放病毒核酸穿过细胞膜进入胞质溶胶，开始病毒多肽的翻译。病毒的繁殖复制需要利用宿主细胞的核糖体以及其他蛋白合成因子，但是病毒产物构成RNA合成系统是病毒繁殖复制中的关键。EV71基因组首先直接翻译出一个由2194个氨基酸组成的多聚蛋白，多聚蛋白在合成的同时，不断被由其本身水解产生的蛋白酶所切割，产生P1、P2和P3三个前体蛋白。P1前体蛋白再经过一系列的加工，最终形成VP1（293个氨基酸）、VP2（254个氨基酸）、VP3（245个氨基酸）和VP4（69个氨基酸）四个病毒外壳蛋白。P3前体蛋白利用非浓度依赖性的自身切割等机制产生3C（具有蛋白酶活性，184个氨基酸）或3CD（具有蛋白酶活性）、3AB（具有起始病毒RNA合成的功能）或3A（86个氨基酸）和3B（末端结合蛋白VPg，22个氨基酸）以及3D（RNA聚合酶，462个氨基酸）。P2前体蛋白的切割产物包括2A（150个氨基酸）、2B（99个氨基酸）和2C（329个氨基酸），这些多肽的功能尚不清楚。
        EV71基因组的复制类似于其他含正链RNA的肠道病毒。当病毒基因组编码的RNA聚合酶3C完成翻译和加工后，病毒基因组便开始复制。病毒基因组RNA首先作为mRNA合成病毒蛋白，然后再作为模板在病毒RNA聚合酶的作用合成负链RNA，后者又作为模板在细胞内质网进一步合成大量的正链RNA。体外实验证实，病毒基因组的复制至少需要病毒RNA聚合酶3C、末端结合蛋VPg蛋白VPg，以及一种以上的宿主细胞蛋白质。肠道病毒基因组的复制可能有两种模式，VPg蛋白结合于所有新合成的正链和负链RNA的5'末端，然后以VPg-pUpU作为引物进行RNA链的合成，而宿主细胞的末端尿苷酸转移酶（terminaluridylyltransferase，TUT）将多聚尿嘧啶核苷酸尾加到模板的3'末端，所形成的发夹结构能作为自身引物合成新的RNA链。
        随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒开始进入子代病毒颗粒的组装阶段。首先，由于蛋白酶3C或3CD的增多以及活性的增强，加速了P1前体蛋白的切割，其产物构成的原聚体组成五聚体，并进一步包装病毒VPg-RNA形成原病毒颗粒（provirion）。一般情况下，肠道病毒的原病毒颗粒无感染性，经过蛋白酶的再加工（水解切割，产生VP1～4多肽）才产生有感染性的病毒颗粒。
        EV71病毒在细胞中的繁殖和复制引起细胞形态以及代谢体系的改变，病毒感染初期（2～3h），细胞的形态由梭形逐渐转变成圆形，感染后6h，胞浆内出现病毒诱导的膜性小泡；在病毒感染的后期（12～20h），新合成的子代病毒颗粒开始出现在细胞浆基质中。细胞核出现明显的固缩现象，最后发展为细胞脱落。由于病毒的感染，细胞RNA、DNA和蛋白质的合成均受到抑制。大部分肠道病毒为杀细胞病毒，直接对靶细胞产生溶解性感染，免疫损伤不是肠道病毒感染的主要发病机制。肠道病毒繁殖迅速，其周期为5～10h。基因组RNA可直接被多核糖体翻译。在细胞被感染后约30min，细胞蛋白的合成迅速降低至零，称为“关闭（shutoff）”。细胞蛋白翻译“关闭” 是肠道病毒细胞病变效应的主要机制。
               三、病毒的致病机制
        EV71病毒主要是通过口腔进入消化道。病毒首先在咽和肠道淋巴组织进行繁殖扩增，然后通过形成病毒血症进行扩散，进一步在网状内皮细胞中扩增，最终侵犯脑膜、脊髓和皮肤等靶器官。病毒的潜伏期大约为2～10d，常见为3～7天，但是患者或亚临床感染者的粪便和含漱液中的排毒期可达数个星期。
        EV71在致病性方面具有肠道病毒所共有的特点，即相同血清型的毒株在同一地区流行会引起临床症状相同疾病的暴发，但是有时也会出现相同血清型毒株分别引起散在的或流行性的临床症状不同（甚至无明显临床症状）的病例。此外，不同的肠道病毒感染可以产生相同的临床症状。两种以上的肠道病毒能够同时在消化道进行繁殖，但是有些情况下，不同肠道病毒在生长繁殖过程中会出现一种病毒的繁殖对另外一种病毒的生长产生抑制的现象。有文章报道，同一血清型EV71毒株感染能够引起临床症状明显不同的疾病暴发，提示不同EV71毒株的致病机制可能有所不同。
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