细胞培养常见问题、可能原因及解决方法

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原作者endosome
问题1：培养液pH 值变化太快中国病毒学自由学术论坛' n! H% t4 P7 m* I

可能原因
（1）CO2 张力不对
（2）培养瓶盖拧得太紧中国病毒学自由学术论坛$ d0 O/ _0 ]9 r& \9 _
（3）NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足
（4）培养液中盐浓度不正确
（5）细菌、酵母或真菌污染
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建议解决方法病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture, |3 R6 l4 @( V; }
（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％ 到10％。
（2）松开瓶盖1/4 圈。中国病毒学自由学术论坛' ]/ w" S( O2 z; m( [
（3）改用不依赖CO2 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。
（4）在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。biosky.haotui.com/ I' V4 m0 S- @8 k; x. o9 O
（5）丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变中国病毒学自由学术论坛7 K/ {+ }1 r$ f- i. }5 S* H
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可能原因
（1）洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来
（2）冰冻保存培养液病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture! J* J0 V- A% v# T1 I

建议解决方法中国病毒学自由学术论坛( J; O; q& P3 z1 p
（1）用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。中国病毒学自由学术论坛6 N3 u4 j3 R+ }' Y2 J; q
（2）将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
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问题3：培养液出现沉淀， 同时pH 发生变化7 N! ~4 x5 I7 l, B

可能原因biosky.haotui.com: ], w$ d7 y3 u0 t
细菌或真菌污染中国病毒学自由学术论坛& b1 U' h; G; Q/ s" \
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建议解决方法
丢弃培养物，或用抗生素除菌。biosky.haotui.com% A* v9 M/ T% |. A# _
biosky.haotui.com8 A# b3 [* L/ C6 h6 V1 n7 ~
问题4：培养细胞不贴壁中国病毒学自由学术论坛' k8 q$ x" A9 b4 ]/ N
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可能原因中国病毒学自由学术论坛! r7 Y: t1 v1 H/ o# q
（1）胰蛋白酶消化过度
（2）支原体污染中国病毒学自由学术论坛& R/ }4 ?  I& k! R; F5 J* }, V
（3）培养瓶瓶底不干净
（4）培养液pH值过碱（NaHCO3分解）! p3 J) r0 B5 h6 ~& l1 w8 T
（5）消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当
（6）细胞老化（如传代前细胞已汇合导致失去贴附性） | 我们一直在努力!' y# U8 o/ p$ I
（7）接种细胞起始浓度太低或太高
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建议解决方法
（1）缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。中国病毒学自由学术论坛# E) o: k8 G, J; X; |
（2）分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。中国病毒学自由学术论坛$ t' {- u; o% b; O+ ]$ b9 Q) W
（3）注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶" R* e( C) R+ {' p
（4）使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2（将培养液敞口放入培养箱也可）中国病毒学自由学术论坛% c% ?" }& P- Z" m
（5）重新配置消化液或培养液中国病毒学自由学术论坛" v% [3 U4 J( l, d1 w
（6）启用新的保种细胞
（7）调节最佳接种细胞浓度 | 我们一直在努力!& }! R6 \7 P9 ^6 }" e
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问题5：悬浮细胞成簇 | 我们一直在努力!! @2 L: H; n4 H. k& o3 ]

可能原因中国病毒学自由学术论坛# g) [) @) ]' z  u
（1）培养液中含钙、镁离子biosky.haotui.com) x; |/ o6 [" B' B
（2）支原体污染
（3）蛋白酶过度消化使得细胞裂解释
（4）DNA污染
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建议解决方法中国病毒学自由学术论坛- C* N/ i. b5 D  ]- j
（1）用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。  M. N. ?( X, V# [/ [  r) O2 Z
（2）分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。中国病毒学自由学术论坛2 J% [, l6 T8 q  Z# \! ^3 l7 I
（3）用DNase I 处理细胞。
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问题6：原代细胞培养物污染biosky.haotui.com5 s% g6 ?( }  D7 M

可能原因" p% [; }$ \/ A& H* \9 ?, ]' p
原代培养组织在进入培养前已污染9 n: ?: q5 n+ V$ t9 h/ Z$ C
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建议解决方法
培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。

问题7：培养细胞生长减慢

可能原因中国病毒学自由学术论坛% N. z' T5 n$ m) R: s# C0 e/ D& u
（1）由于更换不同培养液或血清
（2）培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
（3）培养物中有少量细菌或真菌污染中国病毒学自由学术论坛# `8 [8 s. U2 x- z( R2 `5 b
（4）试剂保存不当
（5）接种细胞起始浓度太低
（6）细胞已老化 | 我们一直在努力!" {( O# z9 T; [
（7）支原体污染
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建议解决方法 | 我们一直在努力!5 L# m2 b& E; w; w
（1）比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。
（2）换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。
（3）用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。中国病毒学自由学术论坛& o$ s, G: W$ v1 Z1 d) q7 L3 x
（4）血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2－8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2 周内用完。 | 我们一直在努力!7 Z# L/ K0 b9 R# r7 [, T: J
（5）增加接种细胞起始浓度。
（6）换用新的保种细胞。
（7）分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

问题8：培养细胞死亡中国病毒学自由学术论坛; t0 {6 V' J8 v0 s
| 我们一直在努力!4 j1 A7 u9 H+ R( e: h# W' x1 C
可能原因
（1）培养箱内无CO2中国病毒学自由学术论坛$ c& f, h4 j$ Z" [
（2）培养箱内温度波动太大biosky.haotui.com- c1 b8 d! u/ {- j
（3）细胞冻存或复苏过程中损伤病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture4 ?  e# ]  {" E% c
（4）培养液渗透压不正确
（5）培养液种有毒代谢产物堆积病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture( Z, z2 q6 B# H. y. q
（6）更多原因参考问题4和问题7中国病毒学自由学术论坛+ ]* ~* n. t7 j  r' [7 h; z
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建议解决方法6 z! H* {" I, T; T$ ^( Y( G
（1）检测培养箱内CO2' `7 |! F. Y% \' c/ G  p' R
（2）检查培养箱内温度 | 我们一直在努力!( K' U/ E" z6 L$ K; o
（3）取新的保存细胞种
（4）检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture/ h. _  p" I3 {7 i2 O
（5）换入新鲜培养液
（6）更多解决方法参考问题4和问题7




细胞培养污染拯救及预防方法
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概论

§污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

§一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。中国病毒学自由学术论坛5 h6 A' n. ~" F. o# h3 _0 k" Q
biosky.haotui.com; n4 r& X! [6 p7 p9 }# t) Q
（一）污染的类型
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§细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。biosky.haotui.com8 T* ^2 I4 W- r0 h3 q

1、细菌污染

§细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture6 `9 |7 N0 c" j1 W& S6 [" _, {$ [5 |. y

§培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。biosky.haotui.com; \2 W0 D$ {' v1 G( Y% {- ~
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2、真菌污染9 A2 t3 m/ T3 c, w6 d9 w

§真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
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§培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。+ R) H- D+ f# }: }+ H* V. z5 W

§真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

3、支原体污染 | 我们一直在努力!9 K$ u5 F! P6 ]8 I/ X( u* Z; R

§支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。biosky.haotui.com6 E& G" P6 f' k3 ^1 W2 t+ l
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§培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

4、病毒污染病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture% X1 f+ p5 X2 O. f% U" r0 \

§组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。中国病毒学自由学术论坛2 B' c4 R: |, h- w

§尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
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5、非同种细胞污染3 q0 a7 l( C9 v
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§由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

§非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

（二）、污染的鉴别中国病毒学自由学术论坛4 @0 J1 o' r# n7 N+ _3 x
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1、细菌、真菌污染的检测

§（1）肉眼观察  
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§细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture# B3 \* J; T( v; h6 T/ z5 }

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§（3）接种观察  

§采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

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§（2）镜下观察  病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture  g% Z/ T( u% N6 w+ e. @; I% W/ e

§在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。
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§若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

2、支原体污染的检测病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture' R$ ?4 m/ K5 t% D6 Y* ^

§（1）相差显微镜观察

§直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。
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§应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
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§（2）荧光染色法观察  

§用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。中国病毒学自由学术论坛- A# \3 y) H" I
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§（3）电镜检测  biosky.haotui.com' |/ D5 M- W6 t

§若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。


细胞冻存、解冻方法与细胞计数 | 我们一直在努力!4 p6 h! z9 [( z2 U
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一、细胞冷冻保存

1.材料：
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生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene　5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)中国病毒学自由学术论坛* }$ r- V9 ?1 @

2、冷冻保存方法：
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（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。中国病毒学自由学术论坛# i2 S& V: l9 m
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-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 | 我们一直在努力!( T  ?- L4 B* W% n/ Y8 t& J& e8 I
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3、步骤：
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（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
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（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture  Q$ m# K8 j8 D' o8 F$ U- m$ Y
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（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。biosky.haotui.com+ v5 v6 x8 S( g$ s1 [

4、注意事项：
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（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。

（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。 | 我们一直在努力!0 ~- H  f, Q' D- h& h3 v, ^6 r6 r
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（4）冷冻保存之细胞浓度： | 我们一直在努力!- _3 T7 j# ~; v) S

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。* P5 u  H- D5 ?- w4 H+ ?8 `3 ~

③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
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④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。biosky.haotui.com6 B% L' ~5 v+ }: O6 V$ k' p
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（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化中国病毒学自由学术论坛; {% \6 B  d5 _" `: B
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1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
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2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。; x( E+ R; U; U+ J! ?
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3、材料biosky.haotui.com9 ?) L" i  X! w8 j% \$ H
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37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
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4、步骤：

（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
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（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。3 A9 q% k& a3 y* i( Q
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（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。中国病毒学自由学术论坛9 `& V8 r9 s: v- o. u. a; p
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（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
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（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
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（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。& y! a( _$ O; P! Y
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三、细胞计数与存活测试中国病毒学自由学术论坛! U0 j/ Z/ g% ~. t- ?+ e+ z/ ~' Z" M

1、原理：
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（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。 | 我们一直在努力!6 m  {# ?! G  I8 d
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（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。 | 我们一直在努力!) `9 W  ^9 x" x7 d, R: j* s
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（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。中国病毒学自由学术论坛# u+ d: ~2 v  |7 C: b% i9 H

3、步骤：中国病毒学自由学术论坛  M9 c* R5 F3 s+ F- v8 `) {) O

（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture- x* P9 J0 U; F/ o9 C+ z# R

（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 | 我们一直在努力!  }& {/ |/ u$ s
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注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml/ m5 f) q( j/ d8 z3 J! e& a, k) Q

计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

5、范例： | 我们一直在努力!: ~/ t, Q- r( g1 y) F/ B7 S

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243病毒学论坛,自由学术论坛,病毒学,交流,病毒,免疫,virus,virology,immunology,cell culture6 j: h0 L4 \& h, a0 v

平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；

细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
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细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106中国病毒学自由学术论坛" w3 t# K- J9 k& G+ F

存活率：225/243﹦92.6%

zhl2016

好贴，学习了，谢谢分享