[转移贴]Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

cao1976

原贴由WIZARD 发表于 2008-4-1 18:31

测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
　　(一)　原理:
　　常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
　　(二)　方法:
　　1.　在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

　　4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
　　5.　末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
　　单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
　　　　　　　　　4个大方格内细胞总数
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀释倍数)
　　　　　　　　　　　　　　4
　　6.　细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活细胞数
　　　　　活细胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　总细胞数
　　用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。　　

(三)　试剂和材料:
　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
　　Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)
　　10％小牛血清RPMI1640
　　0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
　　肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
　　短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
　　无菌干燥注射器针头。
　　碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
　　血球计数板、显微镜、水平式离心机。
　　(四)　注意事项:
　　1.　抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
　　2.　操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
　　3.　用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
　　4.　小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
　　(五)　附录
　　1.　Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
　　　　NaCl 8.0克
　　　　KCl 0.4克

　　　　Na２HPO４·12H２O 0.12克
　　　　KH２HPO４　　　　　　 　　0.06克
　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克
　　　　双蒸水　　　　　　　　　 1000毫克
　　　　1％酚红液　　　　　　　　　 2毫克

　　将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
　　2.　细胞分层液配制法
　　　　9％聚蔗糖　　　　　　　　　24份
　　　　34％泛影葡胺　　　　　　　 10％
　　混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
　　3.　磷酸缓冲液(P
　　原液:
　　A液: 0.2M NaH２PO４溶液
　　　　 NaH２PO４ 　　　　　　　　　　27.6克
　　　　 或NaH２PO４·2H２O 　　　　　　31.2克
　　　　 蒸馏水　溶解至　　　　　　　　1000毫升
　　B液：0.2M Ha２HPO４溶液
　　　　 Ha２HPO４·12H２O 　　　　　　71.6克
　　　　 蒸馏水溶解至1000毫升
　　各种不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
　PH　　　　　7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
　　举例: 　0.1M 　PH7.2PB
　　　　　　A液　　　28毫升
　　　　　　B液　　　72毫升
　　　　　加蒸馏水　 100ml
　　4.　血球保存液
　　葡萄糖　　2.05克　枸椽酸钠　　0.8克
　　氯化钠　　0.42克　蒸馏水　　 100毫升
　　将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。
　　5.　RPMI-1640培养液:

　　　　RPMT-1640(FLOW公司出品)　　　　1袋
　　　　三蒸水　　　　　　　　　　　 1000毫升
　　电磁搅拌30分钟：1N　HCl调PH7.2～7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
　　不完全RPMI-1640培养液:
　　　RPMI-1640　　　　　　　　　　　　　95毫升
　　　0.1M丙酮酸钠　　　　　　　　　　　　1毫升
　　 0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　 1毫升
　　　1M　Hepes 1毫升
　　　7.5％ NaHCO３ 1毫升
　　　青霉素、链霉素(各1万单位)　　　　　　1毫升
　　完全RPMI-1640培养液
　　　不完全1640培养液　　　　　　　　　　90毫升
　　　灭活胎牛(或新生牛)血清　 　　　　　 10毫升

外周血培养基的配制
一、配制用水
  培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基
  培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。
三、血清
  培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。
四、抗菌素
  为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升。
五、植物血凝素（PHA）
  非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过程中，在PHA的作用下，可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。经实验测定其分裂高峰分别于培养后44—48小时和68—72小时。
  PHA有粘多糖，蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，直至全部免疫活性细胞均被激活为止，但PHA浓度过高会引起凝集，一般采用4%浓度为好。