[转移贴]多重PCR同时检测口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒

cao1976

原贴由我容易吗我发表于 2008-5-8 16:33


多重PCR同时检测口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒
作者：未知 来源：动物医学进展 时间：2007-5-24


钟金栋1,花群义2*,肖荣海2,夏雪山1,杨云庆2,周晓黎2,董 俊2,邓祖洪3


（1.昆明理工大学生化学院,云南昆明 650224;2.云南出入境检验检疫局技术中心，云南昆明 650228; 3.西双版纳兽医站,云南景洪 666100）  

摘 要：根据基因库中的口蹄疫病毒（FMDV），猪水疱病病毒（SVDV）和水疱性口炎病毒（VSV）各基因序列，设计了与FMDV，SVDV和VSV互补的3对特异性引物，对样品中的cDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为189 bp，125 bp和300 bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增，均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能特异、敏感、快速地鉴定FMDV，SVDV 和VSV。
关键词：口蹄疫病毒；猪水疱病病毒；水疱性口炎病毒；多重PCR；检测
口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）、猪水疱病(Swine vesicular disease,SVD)和水疱性口炎(Vesicular stomatitis,VS)都是猪的重要病毒性传染病，以口和蹄部产生水疱性损伤为特征，其临床症状极为相似，引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病。3种水疱性疾病在临床症状上无法区别，必须通过鉴别诊断。目前对3种疫病的诊断多采用病原分离及常规的血清学方法，所需时间较长，也有使用PCR技术进行检测的，但还没有建立稳定的操作性强的能同时鉴别3种病毒的方法。为此，有必要建立能同时进行3种疫病快速检测方法，以便尽快采取有效的针对性防控措施。多重PCR技术是在同一PCR体系中，加入多对引物，对多种目的基因同时扩增的分子生物学检测方法，它具有快速、灵敏、特异等优点[1]。因此，建立对FMDV，SVDV和VSV的多重PCR鉴检测方法是十分必要的。本研究利用计算机软件对已知3种病毒基因进行分析，确定出扩增病毒基因的靶序列，设计筛选出适合于多重PCR的FMDV，SVDV和VSV特异性扩增的3对引物，并通过对扩增体系和扩增条件的优化，建立了特异、敏感、快速的能同时检测FMDV，SVDV和VSV的多重RT-PCR方法。
1 材料与方法
1.1 病毒株
猪水疱病病毒RNA、标淮阳性血清、标淮阴性血清和参考样品由英国动物卫生研究所Pirbright实验室惠赠;VSV-NJ病毒株和VSV-IND病毒株从美国国家兽医服务实验室（NVSL）引进，由本实验室保存；FMDV O疫苗株从云南保山疫苗厂引进，由本实验室保存。
1.2 试剂
Total RNA提取试剂盒Trizol Rwgent购于美国Invitrogen公司；三氯甲烷，异丙醇，Taq酶，dNTP Mixture，AMV逆转录酶，RNase Inhibitor，及DNA标准DL 2 000购自宝生物（大连）有限公司。
1.3 引物设计及合成
根据基因库提供的FMDV，SVDV和VSV各基因序列，通过Blast分析软件分别对基因的序列进行分析，选择了高度保守即特异性强的区段，应用计算机Primer软件设计了3对特异性引物，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成，其序列及扩增基因产物的长度见表1。  

表1 多重RT-PCR引物设计结果


Table 1 Result of primer design for multiplex RT-PCR

病毒
Virus
        引物
Primer
        序列
Sequence
        长度
Length
        扩增片段长度
Length of specific fragment
FMDV
        For
Rev
        TTACAAACCTGTGATGGCCTC
CGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTT
        21
24
        189
SVDV
        For
Rev
        TGGTCCAGTACCCACAAAGG
TATGCGTTGCCTATGCCAATG
        20
21
        125
VSV
        For
Rev
        GGCTTCCCATCTACATCCTAGG
TGCCCAAATGTTGCAAGTG
        22
19
        300



1.4 病毒RNA的提取和反转录

取1 mL～1.5 mL组织样品研磨上清液或液体样品置1.5 mL eppendorf 管中，于4 ℃以10 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入1
mL TrizoL，充分振荡混匀，置室温5 min，彻底裂解；加入200 μL三氯甲烷，小心盖上帽盖，用力快速振荡15 s，置室温放置3 min；于4 ℃以10 000 r/min离心15 min；小心吸取上层水相，转移至新的1.5 mL eppendorf管中，加入500 μL异丙醇，混匀室温放置10 min；于4 ℃以10 000 r/min离心10 min，弃上清液；加1 000 μL 750 mL/L乙醇，充分振荡混匀，于4 ℃以10 000 r/min离心5 min，小心弃上清液，管底部可见有乳白色RNA沉淀；小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA；用DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白分析仪检测RNA的纯度和浓度，然后可直接用于反转录或-70 ℃保存备用。
1.5 cDNA的反转录
取1支200 μL PCR反应管，反应总体积为20 μL，RT 5×buffer 4 μL，RNA（5 U/μL）酶抑制剂0.5 μL，10 mmol/L dNTPs 6 μL，下游引物1 μL，AMV（5 U/μL）逆转录酶0.5 μL，灭菌双蒸水补足至20 μL。置室温10 min，42 ℃水浴60 min，最后94 ℃ 5 min灭活AMV逆转录酶，然后置于冰盒，则反转录为cDNA。
1.6 常规PCR及扩增条件优化
PCR反应在带热盖的Gene Amp PCR System 9 700型中进行。分别将上述FMDV，SVDV和VSV的cDNA产物作为模板，在管内分别加入相对的3对引物进行PCR扩增。反应条件以5 μL为模板，稀释好的引物PF和PR各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×buffer 5
μL，25
mmol/L MgCl2
5 μL，5 U/μL
Taq酶1 μL，加水补足50 μL。PCR反应循环参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃复性40 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7 多重PCR扩增
分别将上述1.5合成的FMDV，SVDV和VSV cDNA产物作为模板，在同一管内同时加入3对引物进行PCR扩增。反应条件及PCR反应参数如上1.6。PCR扩增结束后取10 μL扩增产物于20 g/L的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ mL溴化乙锭）中电泳检测。
1.8 PCR产物的检测分析和克隆测序
取10 μL PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭）中电泳检测。配胶及电泳缓冲液均为1×TAE（0.04 mol/L，Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH 8.8），电压为120 V电泳40 min，在紫外凝胶成像系统中观察PCR产物在凝胶中的位置，用DNA Marker DL 2 000为参照判定结果。PCR产物回收纯化后经过与pMD18-T载体的连接反应（16 ℃连接30 min），然后将连接反应液热转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有IPTG和X-Gal的L-Amp平板培养基上培养。挑取白色菌落进行小量培养，碱裂解法提取质粒，送宝生物（大连）工程有限公司测序。
2 结果
2.1 单引物特异性扩增结果
在进行多重PCR之前，先进行单对特异性引物扩增，并对引物浓度进行优化。FMDV检测引物浓度为20 pmol/μL，SVDV检测引物为25 pmol/μL，VSV检测引物浓度为40 pmol/μL时，可以准确地诊断出3种水疱性疾病。从图1可见3种病毒扩增的各个片段与预期设计的片段大小相符。对PCR扩增产物的克隆测序获得的序列，经DNAstar软件分析，这些序列分别与原来的参考序列一致（测序结果略）。

M.DNA标准DL 2 000; 1.猪水疱病病毒；2.口蹄疫病毒；3.水疱性口炎病毒;4.阴性对照;5.细胞对照
M. DNA Marker DL 2 000;1.SVDV;2.FMDV;3.VSV;4.Negative control; 5.Cell control.   

图1 FMDV，SVDV和VSV的特异性扩增


Fig.1 Specific amplification of FMDV，SVDV and VSV

2.2 多重PCR特异性扩增结果
在单对引物扩增条件的基础上，将3对特异性引物加入同一反应管内，以分别在每管加入FMDV，SVDV和VSV的cDNA模板，并在其中一管加入3种病毒cDNA，经多重PCR同时扩增出了189 bp，125 bp和300 bp的特异性片段（图2）。

M.DNA标准DL 2 000;1/6.阴性对照; 2/11.口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒;3/9.口蹄疫病毒;4/8.猪水疱病病毒; 5/10.水疱性口炎病毒;7.细胞对照
M.DNA Marker DL 2 000; 1/6.Negative control; 2/11. FMDV，SVDV and VSV; 3/9. FMDV; 4/8.SVDV; 5/10.VSV; 7.Cell control.

图2 FMDV、SVDV和VSV多重PCR的特异性扩增


Fig.2 Specific multiplex amplification of FMDV、SVDV and VSV  

  
2.3 多重PCR敏感性试验结果
对FMDV和VSV，用BHK-21细胞按karber氏法测定病毒毒价，然后系列稀释成1 000，100，10，1，0.1 TCID50和0.01 TCID50，分别取1 mL提取RNA反转录，多重PCR扩增。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测，结果为FMDV和VSV可检测到1个TCID50的样品，SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性。
2.4 样品检测结果
应用多重RT-PCR对SVDV RNA样品、FMDV和 VSV细胞培养物、乳鼠组织、FMDV送检样品以及正常BHK-21细胞、猪牛的上皮组织等46份样品的检测结果表明，其中有12份样品FMDV检测阳性，7份样品VSV检测阳性。经乳鼠接种试验，与FMDV和 VSV阳性结果一致。
3 讨论
近年来，RT-PCR技术已广泛应用于动物水疱性疾病分子的鉴别和检测。Reid S M等[2]建立了常规RT-PCR对FMDV进行检测。Lin F等[3]在1996年就已经开始用RT-PCR和RT-nPCR这2种方法对SVDV进行检测。Rodriguez L L等[4]在1993年就建立了RT-PCR检测VSV的方法。同时，随着近几年PCR技术的发展，荧光定量PCR也被广范应用于动物水疱性疾病分子的鉴别和检测，花群义等[5]利用Taq Man RT-PCR技术对FMDV进行检测。Reid S M等[6]通过实时PCR仪采用RT-PCR的方法诊断SVD，花群义等[7]利用Taq Man RT-PCR技术对VSV进行检测。但目前这些方法的研究均还未能建立1种一次性检测出这3种疾病的方法。秦智锋等[8]利用基因芯片鉴定水疱性疾病，但目前基因芯片技术成本高，用于检测不利于推广。试验结果证实，本研究建立的多重PCR方法具有特异性高，敏感性强，稳定性好，方便快速的特点，利用该多重PCR技术对FMD，SVD和VS的诊断方法，可对低含量FMDV，VSV和SVDV的含肉制品、隐性感染或持续带毒动物组织样品进行快速、准确检测和对发病动物进行早期快速鉴别诊断。
多重PCR是在同一PCR体系中，加入多对引物，对多种病原体同时扩增的方法，具有敏感、快速、稳定、特异等特点。在建立多重PCR体系中，引物的设计是非常关键的，它决定着方法建立的成败，要求各引物之间不能互补，尤其避免3′端的互补，以免形成引物二聚体；各引物与其他扩增片断和模板不存在较大的互补性，扩增片断之间也没有较大的同源性；对于引物的长度、G+C含量和Tm值要求尽量一致，其扩增片段大小要适宜等，这对多重PCR引物的设计带来了一定的难度。在多重PCR引物设计过程中，充分考虑到多重PCR引物设计要求，使每个病毒引物长度在18 bp～25 bp之间，G+C含量为50％～60％，Tm值尽可能一致。每个病毒的每对引物设计出来了后，既要与同一病毒的不同毒株进行比较，又要同其他病毒的不同毒株进行比较，以确定其良好的特异性。同时，要使PCR反应敏感性高，引物浓度也是一个不可忽略的一个重要因素。
本研究在引物设计上利用扩增片段长度的不同，并通过对引物浓度进行优化，直接判定结果，这使得该方法在结果判定上更简便、直观和实用。通过多重PCR技术可以方便、快速地诊断FMD，SVD和VS。
转自：http://www.bbioo.com/bio101/2007/8813_2.htm