[转移贴]Virus 转染293ft后表达在supernatant的蛋白浓度极低

hantavirus

原贴由kevin312 发表于 2009-4-4 17:28

Virus 转染293ft后表达在supernatant的蛋白浓度极低，据文献只有2-10ng/ml，需要10-100mg/ml的final concentration，请问，如何purify???  非常感谢！

hantavirus

lucky 发表于 2009-4-6 09:44 ：
楼主要问的首要问题应该是如何使上清蛋白" concntration "才对吧,你可以使用浓缩的方法让你的上清蛋白富集.
常用的浓缩方法很多,但是你这种情况可以使用超滤膜浓缩法:利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的,现在有离心管式的浓缩管,只要实验室有台离心机就可以用了.

hantavirus

deepblue 发表于 2009-4-6 10:24 ：

按照你的目的要求，需要浓缩1000-10000倍。2楼提到的浓缩柱能浓缩的volume有限，很难满足你的要求。建议优化实验条件，比如病毒转染的MOI，转染前细胞的confluence等等。如果直接用活病毒感染表达量很低，可以考虑使用载体，可以引入信号肽提高分泌性表达水平。

hantavirus

lucky 发表于 2009-4-6 16:04 ：

同意楼上deepblue的意见。
需要浓缩1000-10000倍，意味着从200ml体系获得2ml-200ul的最终产物或者更大体积的浓缩，常规的离心浓缩方法也是能达到的，但是确实有点费时费力。

楼主可能还需要考虑的问题有:
1、楼主要得到蛋白的目的是什么？是需要大规模制备，还只是进行检测？这将决定你是否应该从新优化实验条件，获得目的蛋白的高表达量。
2、楼主提到"Virus 转染293ft后表达在supernatant的蛋白浓度极低，据文献只有2-10ng/ml",
这些都是什么时候的文献报道,是针对同一蛋白普遍存在的问题,还只是某一个实验室做出的结果?是否有可能通过实验条件的探索，优化表达量？

hantavirus

kevin312 发表于 2009-4-11 18:20 ：

非常感谢二位的回答！
确实，要浓缩1000-10000是非常困难，我没有使用活病毒转染，用的已经是lentivirus3质粒包装系统，目的蛋白实际是一个小片段的peptite，自带了一个signal peptite，其他tag都没有加，怕影响activity，purify的目的是大规模制备，至少要拿到mg级测试其anti-bacteria function，如果优化试验条件后可以用常规离心浓缩方法解决问题，那就最好不过，不然我只有上转瓶了。
请问lucky：超滤膜浓缩法就是这个常规离心浓缩方法吗？  xiexie  !!!

hantavirus

xxx 发表于 2009-8-3 23:38 ：


超滤膜浓缩法不是常规离心哦，是一种切向流的膜包过滤浓缩法！