[转移帖]HEV全基因组克隆 做不出来，郁闷……

cao1976

原始帖451682352 发表于 2010-9-26 15:35 ：

小弟一直在做HEV（正链RNA病毒，粪口传播）的全基因组克隆。可是一直没结果。现在把我的条件拿出来，请各位高手帮我分析一下原因吧，郁闷死了！
一：RNA的提取
    用OMEGA试剂盒提取猪粪中的RNA。（猪粪用PBS溶解）。
二：RT
    反转录用的是MBI试剂盒。RNA定量为1ug。反转录引物用过特异性引物和oligo（dT）。或者两者混合。
三：PCR
    PCR所用引物特异性很好（软件比对结果显示），cDNA加2ul。
四：目的片段
    一个长1.2k。一个约6.35k。1.2k的用的是TAKARA的普通Taq酶。6.35k的用的是TAKARA的LA Taq酶。
结果：
    可以说一直没有结果。1.2kP出的条带都小于500bp，要不就什么都没有。6.35k的结果也一样，要不什么都没有，要不在9.6k处有一条不清晰的带（不可能，因为HEV基因组全长才7.2k）。

说明：RNA肯定是提出来了，因为做阳性筛选的时候扩增的436bp的条带每次重复都会出现，即阳性对照没问题（扩增片段靠近基因组3’端）；RT应该没问题，因为试剂盒中的阳性对照扩增也没问题。
  

    小弟真的很郁闷，一个简单的RT-PCR都做不好，也难怪2个老板都十分恼怒。请各位高手帮我分析分析原因吧，谢谢了！

cao1976

wwwkkk83发表于 2010-9-26 15:39
反转录的酶质量行吗？
能否反转录7.2kb的片段？

Super Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen)
     providing increased specificity, higher yields of cDNA, and more full-length product


病毒RNA没问题吧，  怕降解。。。

cao1976

一只蜗牛 发表于 2010-9-26 17:06 ：

对于病毒长片段扩增，模板质量和量很重要。
1.反转录引物用随机引物试试呢？
另外，cDNA的量会不会少了点，因为越长的片段需要的模板量相对越多
2. 浓缩下你的cDNA试试？或者多加点模板
既然，你出来了一个500bp的片段，会不会是你的病毒和标准株有差异？
3. 将500bp的片段直接送测序，或者做T克隆后测序。
长片段的扩增，对酶的要求就比较高了。
4.你换点别的公司，更好的酶呢？比如invitrogen的，NEB的，stratagene的等等。  

cao1976

bigben发表于 2010-9-26 20:18

是不是粪便里面HEV病毒含量低或者压根没有，你没有提取到HEV的RNA，只是宿主的的RNA、食物的RNA或者细菌的RNA？你怎么确认你提到的RNA里面有HEV的RNA，没有的话，你后面再做也不会有结果啊。

cao1976

walter 发表于 2011-2-25 22:00

能保证你提取的RNA里面有那么长的片段吗，病毒滴度本身就很低，RNA在提取过程中很容易被降解或机械操作断裂，我觉得你一个PCR扩增一个RNA病毒6.35kb长度的基因序列是灰常灰常灰常之困难的！