呼吸道病毒实验室检测技术研究进展

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　呼吸道感染是人类致病和死亡的最主要原因之一。引起呼吸道感染的病原体种类很多, 包括细菌、病毒、支原体和衣原体等, 尤以病毒多见。无论病因如何, 呼吸道感染的临床症状和体征都很相似, 而不同种类病原体引起的感染, 其治疗方法截然不同, 疗效和病程也不尽相同。因此, 快速、准确地检测和鉴别病原微生物有助于临床进行诊断和治疗, 并可用于流行病学的调查及预防性干预措施的制定。

　　随着分子生物学技术的迅猛发展, 呼吸道病毒的检测方法已不再局限于病毒的分离培养和免疫学技术。基因芯片、下一代测序等新兴技术已越来越广泛地应用于呼吸道病毒的快速、灵敏、特异和高通量检测, 以满足患者和临床医生的需求以及促进新型病毒的发现[1]。本文就呼吸道病毒相关实验室检测技术进行综述。

一、病毒分离培养

　　病毒分离培养是呼吸道病毒最经典的检测方法, 亦是诊断的金标准。传统病毒分离培养法是将处理后的鼻咽分泌物接种于敏感细胞, 用含2%的小牛血清基本培养基(minimum essential medium, MEM)37 ℃旋转培养, 连续观察细胞状态, 一般需1~2周的时间, 不利于疾病的早期诊断和治疗, 且部分病毒的分离阳性率很低[2]。上世纪90年代初期, 载玻片培养(shell vial culture, SVC)开始应用于临床, 将病毒接种在含有盖玻片的细胞培养瓶中, 经低温离心后再将盖玻片进行培养, 隔天使用单克隆抗体染色, 显影被感染的细胞。SVC将病毒分离培养与特异性单克隆抗体技术结合, 使病毒分离培养检测时间从过去的8~10 d缩短到1~2 d[3]。由于病毒繁殖具有严格的嗜宿主性, 因此病毒分离培养需要根据不同病毒选择合适的敏感细胞, 如犬肾(Madin-Darby canine kidney, MDCK)细胞最常用于分离流感病毒, 人喉癌上皮细胞(HEP-2)适合培养呼吸道合胞病毒和腺病毒, 鼻病毒和副流感病毒可分别在人二倍体细胞和人胚肾细胞中增殖。传统采用单细胞培养, 往往要先根据不同流行季节和临床症状推测可能感染的病毒, 再选取敏感细胞, 这样的操作耗时费力, 因此中外学者研究采用2~3种混合细胞培养方式, 发现不仅拓宽了病毒培养范围, 而且大大提高了病毒分离率[4, 5]。这种混合细胞培养已有商业化产品应用于临床, 如Diagnostic HYBRIDS公司基于SVC技术, 通过呼吸道病毒荧光抗体池和使用2种敏感细胞建立的可同时检测7种常见病毒的R— Mix ReadyCell技术[6]。

二、免疫学技术
　
　　直接免疫荧光法是将标有荧光素的抗病毒抗体直接与细胞或组织中的病毒抗原反应。其用时短, 操作简便, 特异性和敏感性高, 且不需要复杂的操作仪器, 有利于实验室开展工作, 是现在很多实验室呼吸道病毒检测的主流方法[7, 8]。然而该方法要尽量采取患者鼻咽深部的分泌物, 增加了患者的痛苦。

　　间接免疫荧光法是将特异性抗体先与相应病毒抗原结合形成抗原抗体复合物, 再用荧光标记的二抗与抗原抗体复合物反应, 在荧光显微镜下观察。其优点在于可以同时检测多种病毒, 但是这种方法敏感性低, 受干扰因素多。

　　酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)将酶的高效催化作用与抗原抗体反应特异性结合起来, 可检测呼吸道病毒抗原, 亦可检测相应病毒抗体, 由于其敏感性高、特异性强、无放射性污染, 是目前应用较广的一种呼吸道病毒实验室检测技术。

三、核酸扩增技术

　　现已应用于个体呼吸道病毒检测的核酸扩增技术包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、依赖核酸序列扩增技术(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)、转录介导扩增技术(transcription mediated amplification, TMA)、链替代扩增反应技术(strand displacement amplification, SDA)、环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification, LAMP)、滚环扩增技术(rolling circle amplification, RCA)、解链酶扩增技术(helicase dependent amplification, HDA)、多重依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)等。 其中多重PCR、HDA、LAMP可以针对多个基因靶点同时检测2种以上的病毒。

　　无论患者是否有临床表征, 高敏感性和高特异性的PCR可以检测现有报道的所有引起呼吸道感染的病毒。由于多种病毒同时感染并不少见, 且多重PCR成本低, 能在收集样本后几小时内得到结果, 是现在最具吸引力的检测方法[9]。随着如xTAG®-呼吸道病毒检测试剂盒(respiratory-virus-panel, RVP)等[10, 11]的多重PCR技术平台的建立, 多重PCR在不断地完善和改进。FilmArray是将PCR的嵌套式和多重技术与DNA熔解曲线分析相结合的全自动一体化检测平台, 可以在1 h内完成样本准备、核酸提纯、PCR检测, 整个过程都在密闭管中进行, 基本上没有污染的风险。此外, FilmArray具有能同时检测100种不同目标核酸的潜力[12]。徐昌平等[13]利用双特异性引物(dual priming oligonucleotide, DPO)技术, 有效避免多重引物的非特异性结合, 既保证了扩增的特异性, 又能提高扩增效率。而将荧光标记应用于目的片段分析的多重实时荧光定量PCR也已在临床上尤其是在呼吸道病毒的检测中发挥了重要作用[14, 15]。

　　BERNING等[16]证实, 与PCR相比, MLPA具有更高的敏感性。针对多重PCR的不足, CHUNG等[17]建立了stuffer-free MLPA-毛细管电泳-单链构象多态性(capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism, CE-SSCP)分析法。这一技术去除了MLPA的“ 填充片段” , 简化了探针设计, 称之为stuffer-free MLPA; 利用靶向特异性序列进行pre-PCR, 避免了非特异性扩增; 最后应用CE-SSCP将目的片段长度相似的阳性产物分离出来。依据MLPA现已推出了多种呼吸道病毒多重检测试剂盒, 如RespiFinder-19和RespiFinder-SMART-22。

　　LAMP与NASBA都是基于病原体核酸的等温扩增技术。逆转录LAMP的检测下限可低至10个拷贝数。多重LAMP可在30 min内检测多种病毒及其亚型, 与普通PCR相比敏感性和特异性都高达100%[18]。ZHANG等[19]则首次将多重实时荧光定量与LAMP相结合, 成功应用于8种呼吸道病原体的检测。NASBA是由禽骨髓母细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus, AMV)逆转录酶、噬菌体T7 RNA多聚酶、核糖核酸酶H催化, 一对特异性引物介导的以RNA为模板的扩增技术[20], 敏感性显著高于直接免疫荧光法、快速酶免疫分析法等多种常用方法。

四、芯片技术

　　芯片技术是研究基因组学、蛋白质组学的有力工具。芯片技术与宏基因组学方法可提供快速病毒鉴定。在数据库中寻找可用的序列数据设计寡核苷酸探针, 使芯片能在临床诊断中识别相应的病毒。这种方法可以有助于发现新的病毒, 即使是没有基因恒定区的病毒也可通过测序获得检测结果, 测序加上微阵列芯片则又是一种强大的高通量诊断工具。

　　由Luminex公司开发的流式荧光杂交(flexible multi-analyte profiling, xMAP®)技术衍生的液相芯片技术是一种新型生物技术平台。液相芯片由大小均一的圆形微球构成, 微球上固定带有相应荧光标记的不同分子探针, 最后通过荧光信号的检测判定结果[20, 21]。

　　“ Virochip” 就是一个泛病毒芯片, 由22 000条长寡核苷酸探针组成, 可同时检测几乎所有已知的病毒, 并且与常规检测方法比较, 具有相当或更高的敏感性和特异性[22]。与其相似的还有流感病毒芯片— — FluChip-55 microarray, 专为快速检测流感病毒A及其各亚型(H1N1、H3N2和H5N1等)而设计[23]。

　　蛋白芯片可应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-配体相互作用的研究, 能够分析免疫反应, 对于诊断和生物标志物的发现都很重要。蛋白芯片还可以作为一种快速、灵敏、简单的工具, 用于大规模检测血清中病毒特异性抗体。2002至2003年重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)流行期间, 采用冠状病毒蛋白质芯片筛选人血清(> 600个血清样本), 发现其准确性> 90%, 且特异性高于ELISA[24]。因此, 蛋白芯片是未来病毒感染流行病学研究的一个潜在的强大工具。

五、下一代测序技术

　　从2005年开始, 下一代测序在很短的时间内以其多样本、高通量、多功能的特点从根本上彻底改变了基因组学领域, 使之前由于技术缺陷而无法进行的试验都能得以开展[25]。在过去的5年里, 下一代测序一直应用于新病毒的发现, 许多病毒和菌株用这种方法被鉴别出来, 包括2013年新发现的副流感病毒4[26]。下一代测序具有令人难以置信的敏感性, 它可以同时检测多个患者样本, 确定特定病原体和病毒抗性, 以确保患者得到适当的治疗。虽然与经典Sanger测序相比, 从单个碱基层面上来看下一代测序具有价格优势, 但是对于单个反应来说仍显得昂贵, 且大多数临床实验室对这项技术还没有足够的需求和认知。此外, 样本的制备到数据获得一般需要2~3 d, 一个反应所产生的大量数据还需要有经验丰富的专业型生物信息学人员进行分析。当然这些限制将来一定能得到完善, 最终下一代测序技术将会在呼吸道病毒分子诊断中发挥重要作用。

六、质谱(mass spectrometry, MS)分析技术

　　MS可以提供丰富可靠的核酸、蛋白甚至完整的病毒序列信息, 已成为病原体分子诊断的另一种选择。MS可以与各种色谱分析、亲和技术以及其他分子诊断技术结合应用, 可大大提高其检出限。如基于亲和素法, 与纳米技术结合, MS可以检测痕量靶向病原体。病原体核酸PCR扩增也可与MS相结合作为替代方法。MS具有同时快速检测多种病毒, 甚至是识别蛋白修改位点的优势。现在MS不仅仅用于蛋白质组学分析, 在基因组学中的应用更是越来越普遍。现有的MS类型多种多样, 用于病原体分析的MS类型有基质激光解吸离子化质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS)、表面增强激光解吸离子化质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry, SELDI-MS)、生物气溶胶(bioaerosol mass spectrometry, BAMS)、裂解气相色谱质谱(pyrolysis gas chromatography mass spectrometry, Py/GC/MS)、毛细管电泳质谱(capillary electrophoresis-mass spectrometry)以及液相色谱质谱(liquid chromatography mass spectrometry, LCMS)等, 其中实践运用效力最强的是电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)。SAMPATH等[27]利用逆转录PCR融合ESI-MS技术对1999至2006年间的656例临床患者呼吸道样本进行了分析, 正确检测出92种哺乳动物和禽流感分离病毒, 敏感性和特异性均高达97%。同时在这656例样本中还发现了大约1%的病例含有混合病毒变异株, 这使得人类对病毒进化有了更深一步的了解。逆转录PCR融合ESI-MS技术平台的优势不仅可以对病原体定量, 并且能高效高敏感性地检测多种病毒。

七、其他技术

1. 纳米技术 最新的纳米技术为科学研究又开启了新的发展方向和视角。当物质缩小到纳米级别, 物质属性发生变化, 纳米技术利用这些新的属性与现有技术结合, 发挥特殊功能。

　　免疫PCR是ELISA与PCR的结合, 广泛应用于多种细菌和病毒的检测[28]。PEREZ等[29]使用金标纳米颗粒改进免疫PCR来检测呼吸道合胞病毒, 其检出下限可达到4.1 pfu/mL, 敏感性比ELISA高出4 000倍。

　　如果活细胞成像具有鉴别、量化细胞内生物分子的能力, 那么就会大大有利于疾病的诊断和治疗。然而建立这种病毒检测体系相当困难, 尤其是在感染早期阶段。但是随着分子标记技术的问世, 追踪活细胞内mRNA已成为可能。以此为基础, 金纳米颗粒通过巯醇基与DNA发卡结构相连, 形成金纳米颗粒寡核苷酸探针。DNA环形部分是目标RNA的互补序列, 5'端与金纳米颗粒相连, 3'端连接一个荧光基团。当DNA环形部分与靶RNA杂交时, 荧光基团离开金纳米颗粒而发出荧光, 从而使mRNA成像成为可能。JAYAGOPAL等[30]已使用这种发卡DNA金纳米颗粒在HEp-2细胞中成功检测呼吸道合胞病毒mRNA。

2. 表面增强拉曼光谱术(surface-enhanced raman spectrometry, SERS) 与红外光谱相比较, 拉曼光谱可以避免水分子的干扰, 从物质的天然构象进行生物学分析。即使是对细胞中的单个分子, SERS都具有高特异性、高敏感性和高精确性, 并且以快速无损的形式进行检测[31]。SERS能以DNA、RNA、蛋白以及其他有机化合物为检测目标, 分析核酸的碱基序列和组成以及蛋白或配体等分子间的相互作用, 它可以区分DNA和RNA病毒, 分析不同样本来源的细菌和病毒[32]。

八、总结与展望

　　传统的呼吸道病毒检测的临床样本为血液或咽拭子分泌物等, 采集方法为侵入式, 容易造成患者的痛苦, LIU等[33]用实时PCR检测巨细胞病毒, 比较尿液与咽拭子样本巨细胞病毒DNA拷贝数, 发现两者差异无统计学意义。可见未来呼吸道病毒检测不仅可以从技术上不断革新, 还能从样本来源考虑, 尽量做到无创检查, 将患者可能受到的伤害降到最低。

　　呼吸道病毒是呼吸道感染最重要的病原体之一, 随着抗病毒药物的广泛应用, 越来越多的病毒对抗感染的一线药物产生耐药性, 且近年来不断有新发病毒威胁着全人类的健康, 而快速、灵敏、特异的检测方法有助于疫情暴发流行的控制和防止药物的滥用。传统呼吸道检测依赖于免疫荧光和组织分离培养, 虽然组织分离培养为金标准, 但是检测时间需要几天甚至几周, 因此其结果很难用于临床治疗的指导。免疫荧光由于其可快速检测, 在几个小时内得到结果, 现已作为临床常规方法。目前, 分子检测技术以其高灵敏、高特异、快速的特点日渐成熟。除了上述介绍的方法外还有测流免疫技术(lateral flow immunoassay, LFIA)、流式细胞术等多种新兴检测技术正蓬勃发展, 检测手段也不再局限于一两种方法, 而是多种技术联合应用, 发挥各自的特点, 如低成本的多重PCR技术或新型核酸扩增技术搭载MS、芯片等高通量平台是目前最具有发展前景的病毒检测方法。以上很多技术都已获得认证, 可进入临床试验, 如xTAG®-RVP是美国食品药品管理局(the Food and Drug Administration, FDA)认证的第1个呼吸道病毒多重检测试剂盒, xMAP®技术则是第1个被FDA认证可用于临床诊断的生物芯片技术, FilmArray分子诊断平台和基于纳米金颗粒技术的检测试剂盒也通过了FDA的临床诊断审批, 基于ESI-MS技术开发的PLEX-IDTM系统和RespiFinder多重呼吸道病原检测试剂盒则都已获得欧盟认证。而另一些技术如下一代测序技术、基因芯片技术等虽然应用前景广阔, 但由于还无法完全适应临床需求, 目前仅局限于实验室科研探索中。未来这一领域势必向低成本、小设备、快速、高通量和全自动一体化检测的方向发展。



来源：检验医学杂志　　作者：叶星晨综述, 杨海鸥, 王静审校