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蛋白凝胶染料随心选,不止是考马斯蓝

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发表于 2015-10-26 12:32:19 | 显示全部楼层 |阅读模式
导语:与DNA凝胶电泳一样,蛋白质凝胶电泳也是实验室中稀松平常的工作。无论是Western blot还是质谱分析,都离不开蛋白电泳。研究人员通过大小(1D)和电荷(2D)来分辨蛋白质。当然,仅仅分离蛋白是不够的,它们必须要经过染色。染料的选择有很多,具体选哪种,这取决于灵敏度要求、现有的设备和下游的应用。 ! T0 G' L3 x* H  F4 W
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常规之选- d1 _. \3 c* g) F

% T  |* o' [0 W0 j0 v研究人员主要使用三种染料来处理日常的蛋白凝胶:考马斯蓝、银染和荧光。据Sigma-Aldrich公司蛋白技术的高级研发经理Jeffrey Turner介绍,染料的选择基本上可以归结为“灵敏度 vs. 速度”。
3 a: w3 D) B1 x& @( W' X考马斯蓝也许是最常用的染料。作为一种可见的显色(亮蓝色)染料,它不需要任何特殊的设备。不过,Bio-Rad的业务开发经理Ning Liu认为,它的灵敏度也最低,检测极限大约在10-100 ng蛋白质。0 q$ u; G' I4 P7 `+ p4 l
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很多公司提供不同配方的考马斯蓝染料,它们在使用简便程度、整体染色时间和脱色要求上各有不同。例如,有些需要在乙醇/乙酸中固定,而有些只使用纯水。Expedeon的InstantBlue™试剂可在电泳后直接添加到凝胶中,而不需要固定或脱色,染色可在15分钟内完成。Bio-Rad的QC Colloidal Coomassie Stain操作则建议慢慢来,以便达到更好的效果。整个过程包括在40%乙醇/10%乙酸中固定15分钟,之后染色1-20个小时,再脱色1-3小时。
2 d* F8 H: k/ E有了赛默飞世尔最新推出的Pierce™ Power Stainer,研究人员可以让考马斯蓝染色自动化。据它的产品经理Emily Goplen介绍,这台设备可对两块凝胶进行染色和脱色。“尽管传统的染色需要几小时甚至过夜,Power Stainer却能在10分钟内完成染色和脱色的过程,并且预制胶和自制胶都适用,”她说。/ ^8 i, d8 R6 ]" W( }& B
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另一种常用方法是银染,每条带的灵敏度大约在0.1-0.25 ng。操作过程没有脱色步骤,但是一个很长的过程,大约在2小时左右,而且相当讲究。此外,据Turner介绍,操作需要用到一些有害的化学物质,如甲醛和银,最好在通风橱中进行。因此,人们一般不大愿意用这种方法,除非灵敏度很重要。
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& d" y' f+ u$ T, \. W# v$ h* _$ F9 A荧光染料的灵敏度则居中,可检测几纳克的蛋白质,不过你得有一个兼容的凝胶成像系统或透射仪。与考马斯蓝和银染一样,荧光染色通常在电泳后进行,需要固定和脱色,不过也有例外。例如,SYPRO Ruby需要脱色,但Oriole和Flamingo不需要,因为游离的染料不发荧光。“染料本身不会被激光激发,只有当它与蛋白结合时才被激发,”Liu解释道。
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除了这些常规的染料,你还有一些特殊的选择。例如,赛默飞世尔为糖基化和磷酸化的蛋白提供了Pro-Q荧光染料,同时也提供InVision™ His-tag In-gel Stain和Lumio™ Green Detection Kit来检测带标签的蛋白。
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% ]4 @0 `3 ]- x. [8 W( C升级之选) ^/ ^! l" X; A
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有些染料则让你省去了电泳后的洗涤和染色。比如,Bio-Rad的Stain-Free™预制胶预加了一种与色氨酸结合的“三卤”荧光染料。电泳后,凝胶暴露在紫外线下会激活染料,使其与蛋白质共价结合。据介绍,这种染料的灵敏度与考马斯蓝差不多。
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另一个选择是GE Healthcare的Amersham™ WB系统。有了这个系统,样品在电泳之前与Cy 5荧光基团偶联。据GE Healthcare的资深科学家Åsa Hagner McWhirter介绍,在电泳过程中,游离的染料会跑出凝胶,因此没必要脱色,而且灵敏度在50-100 pg的范围。更方便的是,这个系统在电泳结束后自动对凝胶成像并分析结果。# N. V/ ?( k1 D4 [4 _
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Liu和McWhirter都指出,电泳前染色的方法有一个明显的优点,就是染料与分离后的蛋白共价结合。因此,在后续的步骤中能够观察这些蛋白,特别是在Western blot中,可利用总蛋白的信号来标准化目标蛋白的信号,而不像平常那样用看家蛋白。$ M- J+ F# k/ p& g

) K0 w. P0 |$ o  v2 T, q3 Q  T% K“这种方法明显消除了人们对看家蛋白对照的两个担心,”Liu表示。第一,在不同的实验条件下,看家蛋白的水平有时候会变化。其次,它们的水平可能超出了检测的线性动态范围,使得定量变得复杂。《The Journal of Biological Chemistry》杂志也建议使用总蛋白水平来进行信号强度的标准化。
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McWhirter认为,预标记也明显提高了凝胶之间的重复性,因为洗涤和染色的步骤难以精确控制。“不同反应间的CV要比在不同溶液中孵育凝胶要低得多,”她指出。事实上,她声称在内部分析14个样品时,Cy5信号的CV大约在5%。“这基本上和移液误差差不多。”
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9 K# V3 D3 G! C关键考虑
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  V; C7 n0 s8 z. L+ T& }, L; X6 x& i无论你选择哪种染料,在考虑灵敏度、速度和硬件要求外,你还要考虑下游怎么处理凝胶。若是印迹杂交,研究人员通常不用考马斯蓝染色,因为染料需要固定的步骤,会将蛋白困在凝胶里。他们要么平行跑一块相同的胶,要么在转印之后对印迹膜染色。同样,与蛋白共价结合的染料有可能干扰抗体结合或质谱分析。0 U& J/ a) G& |

5 Y3 D2 v# x1 t1 R6 ], }当然,并没有一个放之四海而皆准的解决方案。考马斯蓝是大多数研究人员的首选染色,但在特殊情况出现时,我们还是有很多其他的选择。2 h( Q* v4 K- G* V
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# R6 e* h! ?& \" Q4 L本文来源:生物通. Y' U2 y4 q' L" x: P0 k. s
http://www.ebiotrade.com/
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发表于 2016-1-15 23:41:14 | 显示全部楼层
InVision™ His-tag In-gel Stain是用于检测含有his标签的蛋白吗?
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