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发表于 2015-1-31 20:04:10
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九、后续工作
7 K f" B5 m8 v5 d( D, J6 V) E- k; a; R, T q6 q2 a
克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。. e4 }1 T9 e% H$ D; H- O
7 X D3 p3 y: H" r' [; B6 t (一) 克隆化方案
8 D, J o; A u; T j% D 用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
! V8 _/ p' [" Y6 f- i5 k 1. 有限稀释法的程序
) l( F p i0 b7 d5 S" v ① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
3 s( z+ x/ | r. S ② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml4 h/ l6 i L0 z! l6 Q T
③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。
8 C, `! U" E' `7 F. b ④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。
8 N# d6 a; }$ x7 _* f/ A6 G ⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。, f( Y7 u8 [6 B. v3 K/ K6 r+ u y5 p
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
7 q5 k6 w. W% e 2. 软琼脂法
3 w* D {( O; r( \ ① 软琼脂的配制
( H9 p: e0 s4 | ~$ s* k 含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
& F0 N/ W# i; s3 ]( Z 1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
' |/ I/ M& v" Z8 e* e2 s$ h; g4 \ 0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。$ z' K9 P! L" h7 z
② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。! Z" s/ j1 M! ]# v m
③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。8 E. `3 L) S. Q
④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
# C% H) r; M* t% ^& z' w2 l, V* n4 ~ ⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。) d0 r7 D0 g# V& j
⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。1 ^' U, k V* l! \4 F) O
⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。
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& U. A! x2 ]& r$ ]( w (二) 杂交瘤细胞的冻存
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- d9 N9 J; p w# o 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。, F. z4 `+ V' b) S* d, Y
) D$ M6 s* F' ^, d! V' a- {
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一管。2 _9 h* m. G+ y' i
细胞冻存液:
" G% j5 J, r) ~4 N 50%小牛血清+ t* e: Q# _. t* S1 S$ l
40%不完全培养液0 ?9 l3 `" }5 w# \6 Q
10% DMSO(二甲亚砜), F4 ]" }* X: U' V% S
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 |
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