人巨细胞病毒感染的诊断方法

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　人巨细胞 病毒(Human Cytomegalo virus，HCMV)，在全世界不同种族人群中都是普遍存在的病原体，感染率很高，其流行因地区和社会经济状况而有区别.北美和欧洲成年人群中血清抗体阳性率为50～80%，而亚洲与非洲的人群中血清抗体阳性率近100%，社会经济状况较好的成年人感染率较低，相反社会经济状况较差的人群感染率高.HCMV的毒力较弱，侵入机体后一般不会使器官和组织受到严重损伤，但一旦该病毒基因整合在受精卵细胞 的相关基因后，则可阻止或影响后者的复制和表达，最后导致不可逆的形态和结构的异常.临床表现为巨细胞 包涵体病.病儿有肝脾肿大、血小板减少性紫癫及溶血性贫血，少数是先天性畸形，如小头，智力低下，神经肌肉运动障碍，耳聋，脉络膜视网膜炎等，由于HCMV引起先天性畸形常在出生后几月～几年内表现症状，主要为智力低下，因此是围产医学和优生学中的重大研究课题.免疫缺陷患者及免疫抑制治疗，肝、肾、心脏等器官移植，肿瘤及骨髓移植等可产生广泛的HCMV感染，骨髓移植患者三分之一以上可兼发有症状的HCMV感染并导致间质性肺炎，后者病死率高达85%，因此HCMV感染是目前导致骨髓移植失败的重要原因之一.AIDS患者又继发HCMV感染后，40%的患者出现内脏感染，最常见的是视网膜和胃肠损害及中枢神经系统疾患.单核细胞 增多症是HCMV感染所致的又一常见疾病.病原学检查表明，大约8%的单核细胞 增多症的病原体是HCMV，临床表现为发热，颈淋巴结肿大，咽扁桃腺炎、肝、脾肿大和皮疹等.
　　最近有关HCMV致病性的重大进展是:HCMV感染在人类动脉粥样硬化中起关键作用.HCMV的重要生物学特征是可导致病毒持续性或潜伏感染并且具有转化能力，新近许多报道已在人动脉粥样硬化中检出HCMV抗原及病毒DNA，并证实这些抗原及DNA多见于病灶周边组织或轻度病灶.进一步研究还揭示:人动脉平滑肌细胞 中不但有HCMV潜伏及复制，还发现了HCMV的受体.用PCR技术则发现了具有转化能力的HCMVmtrII基因.动脉细胞 感染HCMV后，胆固醇代谢可发生改变并在病毒感染局部积累，并且HCMV感染可吸附多形核白细胞 诱生炎性反应致内皮细胞 受损.

HCMV分子生物学 　
　1.HCMV DNA结构特点:在疱疹病毒科中，HCMV基因组最大，约235～240kb，分子为150～160×103 KDa，其结构与HSVDNA相似，具有一个长单一序列(Ul)和短单一序列(Us).Ul和Us的相连处及两端均有DNA重复序列，Ul约115×103KDa，占CMV基因组73%;Us为23.6×103 KDa，约占16%.Ul两端的两个反向重复序列占9%;Us两端的两个反向重复序列约占2%.HCMV以等分子浓度的四个异物体存在，至少编码氨基酸残基数100以上的多肽200余种，包括原始基因产物，中间产物及终末产物.HCMV的基因也分为IE(即刻早期)，E(早期)和L(晚期)三类，其中IE区位于Ul一个小于20kb的区段内，这在位置上不同于HSV.目前，已知HCMVDNA只有一个单向性的IE启动子复合体，它可能指导多个基因的表达，IE及E基因的转录与宿主细胞 的RNA多聚酶Ⅱ有关，其表达受靠近启动子的序列调控，此调控可分为顺式或反式调控.
　　2.HCMV基因转录--翻译的调控:HCMV基因的转录及翻译受其自身及宿主细胞 的调控，并具有时性，分IE、E及L.IE及E基因的转录与宿主细胞 的RNA多聚酶Ⅱ有关，其表达受靠近启动子的序列调控，此调控可分为顺式或反式调控，L基因的转录--翻译受IE及E基因和蛋白的调控.IE蛋白(IEP)对自身及E和L基因的表达均有调控作用.HCMV.AD169株DNA具有2个促进IE基因表达的增强子，一个为主要IE基因增强子，位于U1区末端的PstI-m片段内，另一个位于US区的HindⅢ片段内，调控一组未确定的IE基因转录.DNA序列分析结果表明，IE基因上游的启动子区有多外回文结构，并相间着重复序列，这些序列很保守，推测IEP可能通过回文结构而识别“茎环”结构，促使ORF编码的蛋白质合成，这些蛋白质再依次激活其它启动子或与IEP共同作用促进其它基因的转录.
　　3.HCMV基因转录的时相性: 　　(1)IE期:HCMV感染后0～2h，不需预先合成病毒蛋白，通过细胞 RNA多聚酶Ⅱ，立即转录合成IEP，该期无病毒DNA复制，编码IEP的基因位于Ul区0.66～0.77基因单位处，少量IEP的基因位于长重复序列0.01～0.035和0.795～0.825基因单位处及Ul的0.2～0.260基因单位处，HCMVAD169株至少含IE1、IE2、IE3、三个外显子，编码四组IEP即IEP1、IEP2、IEP3和IEP4.IE1编码68及72KDa即IEP1和IEP2两种蛋白质，72KDa的IEP为主要I，IEPL从IEPE这两种蛋白在细胞 内具有再分布现象，可能与调控基因表达的不同作用有关，对HCMVTowne株MIEP进一步研究，发现编码该蛋白的基因为1个ORF，含4个外显子，翻译从第2个外显子开始，编码491个氨基酸残基的多肽、为磷蛋白、主要集中于核内，能为染色质结合，为病毒及宿主细胞 DNA复制的主要调控蛋白.MIEP能抑制IE增强子激活，对自身起负调控作用，但可促进E及L基因的启动子与病毒DNA多酶及RNA多聚酶Ⅱ作用，使其产生正调控作用. 　　(2)E期和L期：HCMV感染后2～4h，病毒DNA尚未复制，此时为E期，此时病毒的RNA能与DNA的许多区域发生杂交，最富集的区域位于U1区的0～0.046基因单位处.早期蛋白(EP)是重要的功能蛋白，其主要作用之一是与合成病毒DNA多聚酶，诱导病毒DNA复制有关HCMV感染后36～48h，病毒DNA复制开始并合成晚期蛋白，该蛋白是形成病毒结构蛋白的主要成分，该期以大量病毒结构蛋白产生及感染性毒粒释放为其特征.

HCMV病原学检测
(一)血清学诊断方法 　　HCMV感染的血清学诊断方法通常有补体结合试验(CF)，酶免疫试验(EIA)等，CF法敏感性低，而EIA则在高效价血清标本检测时分辩率低下. 　
　1.CF法：用于CF法的抗原大多数从感染CMV实验株如AD169的成纤维细胞 中提取，抗原提取方法往往会影响检测效果，几年前的重要改进是用甘氨酸提取CMV的CF抗原，增加了实验的敏感性.尽管如此，CF法敏感性很低，因而目前不再应用. 　
　2.EIA法： 　　(1)EIA法检测CMV抗体：有好几种CMV抗体检测ELISA试剂盒供应，一般几小时可出结果，许多比较性研究证实ELISA抗体效价高，操作容易，无需虑及血清的抗补体作用，但在ELISA检测中，某些血清与正常细胞 抗原有非特异性反应而产生假阳性，若提高起始稀释度以排除假阳性又会降低实验的敏感性，故需做重复试验并设定正常细胞 抗原对照.CMV特异性的IgM-ELISA试剂盒已有供应，但如同所有的IgM检测一样，可能受类风湿因子等干扰，因而血清标本需预处理.CMV的血清检测也包括中和病毒感染的抗体测定，血清的中和抗效价常不变，很少超过1∶2000，试验需要活性良好的补体，有一定技术难度. 　　(2)EIA法检测CMV抗原 　　用单克隆抗体进行EIA，检测CMV抗原是近几年研究的重点，现已可测定CMV的中和抗原(至少3种蛋白质)，及各种结构蛋白，调节蛋白.单克隆抗体能在感染后的几个小时内检测到成纤维细胞 核内的CMV抗株，离心可帮助CMV吸附于单层细胞 ，效果可提高4倍，尿与气管肺泡洗液的培养结果尤佳.但由于血液白细胞 层常有细胞 毒性，经离心会使单层细胞 受损，反而降低了检测阳性率.
　　3.乳胶凝集法 　　乳胶凝集法测定CMV抗体是筛选血、器官供体的重要方法，几分钟内可出结果，误差5%(包括假阴性)，判定结果的主观性是误差的明显因素.
　　4.免疫吸印法 　　将高分辨率的凝胶电泳和高灵敏度的免疫固相检出法相结合，凝胶电泳使混合在一起的病毒成分和细胞 成份分开，再通过敏感的生物分子亲和技术检测，克服了CF试验敏感性差，EIA分辨率低的缺陷.同时，整个反应只需16h左右即可作出明确的诊断，快速且简便.HCMV主要结构蛋白150和38KDa出现于大部分病人血清中，并与HCMV-IgG、HCMV-IgM均起反应，极具代表性，可作为感染HCMV感染的指标.
(二)核酸杂交 　　目前HCMV感染的诊断技术已从生物学病毒分离防和免疫学检测抗原抗体，进入到对基因组进行诊断的分子生物学水平阶段，通过标记的核酸探针用分子杂交方法检测标本微量的病毒DNA，具有特异性强，灵敏度高的优点.同时此法，不仅能诊断HCMV的活动性感染，而且还能确证潜伏感染.用高比活性放射性同位素检测HCMV，DNA克隆片段及放射自显影检测方法.灵敏度可达0.5pg，特异性可达100%.如用光敏生物素标记探针检测HCMVDNA，灵敏度达10～50pg，由随机引物延伸法和缺口平移法标记的生物素探针灵敏度分别为10～50pg和10pg.

(三)病毒的分离: 　　从临床标本中分离CMV是一种确切的诊断，所有新的测定法均须与之比较.HCMV感染宿主范围窄，只在人成纤维母细胞 中增殖，增殖非常缓慢，初次分离需1个月才出现细胞 毒，细胞 肿大形成巨细胞 性细胞 ，肿大的细胞 核内和胞浆内可查见嗜酸性包涵体，在不利条件下CMV的感染性迅速减弱，且一些生长迅速的疱疹病毒或真菌会使单层细胞 受损而影响CMV的分离.

(四)DNA扩增 　　扩增HCMVIE及L基因片段是目前用PCR法检测HCMV感染主要方法，单纯的PCR法检测HCMV，灵敏度为0.15fg，敏感性，特异性均为100%.检测时只需5μl的临床尿样标本和血液标本. 　　1.扩增HCMV的引物设计部位与序列及意义.PCR扩增HCMV的引物设计主要针对HCMV的IE，E和L基因进行.PCR检测HCMV的引物序列及其定位

引物或探针
序列(5'～3')
扩增产物长度(bp)
基因
位置
第1组(巢式PCR) PL1 TGAGGATAAGCGGGAGATGT L 1729～1748bp PL2ACTGAGGCAAGTTCTGCAGT 242L 1951～1970bp PL1' AGCTGCATGATGTGAGCAAG L1767～1786bp PL2' GAAGGCTGAGTTCTTGGTAA 146L 1893～1912bp 第2组 PIE1CCAAGCGGCCTCTGATAACCAAGCC MIE 731～755bp PIE2 CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTG435MIE 1165～1150bp GAGGCTATTGTAGCCTACACTTTGG MIE 900～925bp 第3组 PL3CACCTGTCACCGCTGCTATATTTGC L 2101～2125bp PL4 CACCCAGCAGCGGCCCTTGATGTTT400L 2500～2476bp GTCGCCTGCACTGCCAGGTGCTTCG L 2301～2325bp 第4组 PIE3GCAGAGCTCGTTTAGTGAACC IE -21～-2bp PIE4 CCGTTCCCGGCCGCGGAGGC 107IE66～85bp 　　2、应用PCR检测HCMV的评价　　在人类疱疹病毒中，HSV、VAV和EBV的基因组序列已全部测出，分别由152260bp(HSV-1)、124884bp和172282bp组成，具有240Kb的CMV(AD169)DNA序列测定也将完成.HCMV的IE基因，E基因和L基因是PCR引物设计的靶基因.从目前的PCR检测结果得出，单用一对PCR引物可引起假阴性，主要原因可能是临床标本中HCMV毒株的不同或病毒基因组中极微小变异(及病毒拷贝数太低)所致.此外，即使引物设计所选的序列针对HCMV同一基因的不同部位，其PCR扩增结果也有明显差异.
IE基因中针对不同部位的引物进行PCR扩增的阳性率

病毒区域
引物序列(5'--3')
扩增产物长度(bp)
阳性率
IEP1A AGATCGCCTGGAGACGCCAT
103
100%
IEP1B GGAATCCGCGTTCCAATGCA
IEP2A ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG
72
100%
IEP2B CCGTGGCACCTTGGAGGAAG
IEP3A GTGACCAAGGCCACGACGTT
167
79%
IEP3B TCTGCCAGGACATCTTTCTC
IEP4A ACAGATTAAGGTTCAAGTGC
IEP4B CAATACACTTCATCTCCTCG
179
33%
IEP5A TTACCAAGAACTCAGCCTTC
IEP5B GTGCGTGAGCACCTTGTCTC
158
60%
　　用针对不同基因的两对引物进行PCR可能避免假阴性产生.此外用巢式PCR也可提高检测的敏感性和特异性.其它需要解决的问题是:①不同HCMV毒株DNA序列扩增的长度有差异、应注意区别.②其它疱疹病毒或无关病毒的同源性序列的干扰.③应建立敏感可靠且实用的CMV序列扩增法，避免交叉污染.④是否发现某些CMV的DNA序列就是以确定感染或所输的血或移植的器官会传播疾毒. 　
　3、应用PCR技术进一步研究HCMV的课题及方向 　　①建立和完善最适合中国国情的检测HCMV的PCR方法.目前用于PCR扩增的引物序列均取自于国外HCMV毒株主要取自Towne和Ad169株，这两种毒株的DNA序列与我国流行的HCMV序列有无差及这种差异是否影响PCR扩增的特异性和敏感性尚无研究结查报道.而这方面的研究又是推广和应用PCR检测HCMV的关键，因此，必须进行深入探讨，建立一种适合我国国情和HCMV流行检测的PCR方法. 　　②用于构建含HCMV启动子的DNA疫苗的研究：将编码某种蛋白的外源基因直接导入动物细胞 可达到免疫接种的目的，这种核酸(RNA或DNA)既是载体，又是抗原的来源，具有疫苗的功能，称为核酸疫苗.目前研究最多的是DNA疫苗，由于不需要任何化学载体，又称为裸露DNA疫苗(naked DNA Vaccine).大量实验证明，DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力.DNA或RNA疫苗的构建是将目的基因的cDNA插入质粒中，并置于适当的启动子控制之下.目前DNA疫苗中所用的质粒载体均含有真核生物启动子.如来源于呼吸道合胞病毒(RSV)，SV40和CMV的启动子以及人β肌动蛋白质启动子，脂酸结合蛋白启动子等，目的基因置于这些启动子的直接控制之下.一种优化的以V1和pUC19为基础的VIJ载体系列已经构建，该载体以去除Lac操纵子的PUC为骨架，将CMV的IE1增强子，启动子，内含子转录调节因子和牛生长激素聚A序列与其连接，在该载体的适当位置插入目的基因.在构建含CMV的启动子的DNA疫苗载体时，可以用PCR扩增启动子的序列，提高构建质粒的速度和质量. 　　③研究CMV与肿瘤的关系 　　有资料显示CMV与宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、Kaposi肉瘤、成纤维细胞 癌、Wilm肿瘤及结肠癌等肿瘤的发生有关.CMV引起肿瘤发生可能通过:①激活细胞 ，使细胞 转化;②诱使细胞 染色体畸变;③激活细胞 癌基因.三者在肿瘤发生过程中可能相互促进.HCMV基因组中有3个诱导细胞 形态转化的形态转化区(morphological transforming region，mtr)，分别定名为mtrⅠ、mtrⅡ、mtrⅢ.mtrⅠ位于HCMVAD169基因组上U左侧末端的HindⅢE片段中，定位于0.123～0.140基因图谱之间.mtrⅡ和mtrⅢ定位于HCMVTowne株DNAXbal-E片段上，图单位0.680～0.770.用PCR扩增这些区域并进行克隆和测序，研究其转化细胞 的功能及据这些区域设计PCR引物对上述肿瘤进行流行病学调查，研究CMV与肿瘤发生关系及机理具有重大意义.